Bir Fare Omuriliğinden Primer Karışık Glial Hücre Kültürlerinin Oluşturulması

Özet

Kaynak: Malon, J. T., et al. Yetişkin Fare Omurilik Dokusundan Primer Karışık Glial Kültürlerin Hazırlanması. J. Vis. Exp. (2016).

Bu videoda, yetişkin fare omurilik dokusundan birincil karışık glial hücrelerin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Protokol, dokunun enzimatik sindirimini ve ardından tek hücreli bir popülasyon elde etmek için kırık hücre zarlarının ve miyelin kalıntılarının çıkarılmasını içerir. Hücreler daha sonra karışık glial hücre büyümesi için optimize edilmiş ortamda kültürlenir.

Protokol

1. Aseptik Koşullar Altında Bir Kültür Davlumbazında Çözeltilerin Hazırlanması

1. Kültür ortamını hazırlayın: Dulbecco'nun DMEM (4.5 g / L glikoz ile),% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IU / mL penisilin, 100 mg / mL streptomisin, 250 ng / mL Amfoterisin B ve 50 μM 2-merkaptoetanol (2-ME; bkz. 1.1.1). Karıştırın ve süzün, diğer tüm bileşenleri sterilize edin ve ardından FBS'yi ekleyin. Kültür ortamını 4 ^°C'de saklayın.
   1. 50 mM 2-ME / fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) stok çözeltisi hazırlayın: 28,6 mL 1x PBS'ye 100 μL konsantre 2-ME (14,3 M) ekleyin ve filtre sterilize edin (çözelti birkaç ay boyunca 4 ^° C'de saklanabilir). Her 1.000 mL kültür ortamı için 1 mL 2-ME stok çözeltisi kullanın.
2. Yoğunluk gradyan ortamının hazırlanması
   1. 1 kısım 10x normal steril PBS ve 9 kısım steril stok yoğunluğu gradyan ortamından (örn. Percoll) bir stok izotonik yoğunluk gradyan medya çözeltisi (örn.% 100 Percoll) hazırlayın.
   2. %20 yoğunluklu gradyanlı bir ortam yapmak için %100 yoğunluklu gradyan ortamını (1.2.1'de yapılmıştır) normal 1x steril PBS ile seyreltin (örn., 40 mL 1x PBS ile 10 mL %100 yoğunluklu gradyan ortamı) ve 4 ^°C'de saklayın. Hücre kültürünü hazırlamadan önce %20 yoğunluklu gradyan ortamını oda sıcaklığına (RT) getirin.
3. Papain ayrışma sisteminden çözeltilerin hazırlanması
   NOT: Papain ayrışma sistemi Malzeme Tablosunda tanımlanabilir. Diğer benzer ayrışma kitleri (şirket içinde monte edilenler dahil) de kullanılabilir. Tüm bileşenler steril olmalıdır.
   1. Ovomucoid inhibitör karışımına (toz) 32 mL Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) ekleyin.
   2. Bir papain şişesine (toz) 5 mL EBSS ekleyin. Papain şişesini 10 dakika veya papain eriyene kadar 37 ^° C'lik bir su banyosuna koyun.
   3. Bir DNase şişesine (toz) 500 μL EBSS ekleyin. Yavaşça karıştırın.
   4. Papain şişesine 250 μL DNaz çözeltisi (yukarıda) ekleyin.
   5. Gerekli olan yukarıdaki papain / DNaz karışımının toplam miktarını hesaplayın (fare omuriliği başına yaklaşık 800 μL papain / DNaz karışımı) ve gerekli karışımı doku sindirimi için 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Artıkları orijinal şişede 4 °C'de en az iki hafta saklayın.
   6. Kitlerdeki tüm bileşenleri ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutun.
4. Omurilik toplama tüplerini hazırlayın: 5 mL Hank'in dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS; papain ayrışma sisteminden, omurilikleri toplamak için) içeren bir steril 15 mL tüp ve 1x PBS'li bir steril 15 mL tüp (5 mL şırıngayı doldurmak için). Ek olarak, 5 mL HBSS içeren bir steril petri kabı (35 mm veya 60 mm) hazırlayın ve kültür başlığında saklayın.

2. Tek Hücreli Süspansiyonun Hazırlanması

Not: Her şeyi steril tutmak için bir kültür başlığında 3. ve 4. adımları gerçekleştirin.

1. Tüm omurilikleri HBSS içeren petri kabına aktarın. Omuriliklerin her birini steril makas ve forseps ile birçok ince, küçük parçaya kesin. Omurilik dokusunu, steril forseps veya 10 mL'lik bir pipet kullanarak hazırlanan papain / DNaz enzim karışımını (adım 1.3.5) içeren 50 mL'lik konik tüpe aktarın (enzim karışımına HBSS eklemekten kaçının, çünkü bu, hazırlanan enzim çözeltisini daha da seyreltir ve enzimin performansının düşmesine neden olabilir).
2. Karıştırmak için tüpü hafifçe girdaplayın. Tüpü 37 ^{° C'de}1 saat boyunca 150 rpm'de orbital sallama ile bir inkübatörde / çalkalayıcıda inkübe edin.
3. Tüpü tekrar vorteksleyin ve daha fazla ayrışmayı teşvik etmek için 5 mL'lik bir pipet kullanarak enzim çözeltisini doku ile kuvvetlice ezin.
4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
5. Santrifüjleme sırasında, steril bir tüpte 2.7 mL EBSS'yi 300 μL sulandırılmış albümin-ovomokoid inhibitör çözeltisi (1.3.1) ile karıştırın. 150 μL DNaz çözeltisi ekleyin (adım 1.3.3).
6. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini yukarıda hazırlanan çözelti ile yeniden süspanse edin (adım 1.5). Hücre peletini kırmak için iyice girdaplayın.
7. Hücre süspansiyonuna 3 mL sulandırılmış albümin-ovomukoid inhibitör çözeltisi (adım 1.4.1) ekleyin. RT'de 6 dakika boyunca hücreleri 70 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı (zar parçaları içeren) çıkarın.

3. Miyelinin Tek Hücreli Süspansiyondan Daha Fazla Çıkarılması

1. Hücre peletini içeren tüpe 8 mL %20 yoğunluk gradyan ortamı (adım 1.2.2'de hazırlanmıştır) ekleyin, peleti bozmak için hafifçe girdap yapın ve hücreleri frenlemeden RT'de 30 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Üst kalıntı tabakasını (çoğunlukla miyelin) ve süpernatanı dikkatlice çıkarın, ancak peleti saklayın.
2. Yoğunluk gradyanının kalıntılarını çıkarmak için, hücre peletini 8 mL seyreltilmiş cDMEM (1 kısım cDMEM ve 2 kısım HBSS) ile yeniden süspanse ederek hücreleri yıkayın. Hücreleri 400 x g'da 4 ^{° C'de}10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri aynı şekilde seyreltilmiş cDMEM (yukarıda) ile tekrar yıkayın. Hücreleri tohumlayana kadar buz üzerinde tutun.
3. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini kültür ortamında yeniden süspanse edin (2-ME ile birlikte verilen cDMEM (adım 1.1'de hazırlanmıştır)). 12 oyuklu bir plaka için 3 mL x 4 (kullanılan fare sayısı) + 2 mL = 14 mL ortam kullanın. Bu, tüm plaka (12 kuyucuk) için yeterli hücre süspansiyonu olmasını sağlayacak ve oyuk başına ortalama hücre sayısını ve kültürün mikroglial içeriğini belirlemek için kullanılabilecek ekstra kuyucuklar sağlayacaktır. Başka türde kültür kapları kullanılacaksa, ihtiyaç duyulan kültür ortamının toplam hacmini orantılı olarak hesaplayın.
4. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
5. Hücreleri 35.9 ^{° C'de}% 5 CO₂ ile inkübe edin.
6. D 1'de ve daha sonra her 3 - 4 günde bir ortamı değiştirin (eski ortamı aspirasyon yoluyla çıkarın) (tipik olarak D: 1, 4, 8 ve 11'deki ortamı değiştirin ve ardından hücreleri 12. günde kullanın).
   not: 1. günde, kültür, omurilik dokusundan kalan miyelin kalıntısı nedeniyle önemli miktarda kalıntı içerebilir; Bu nedenle, medyanın 1. günde değiştirilmesi önerilir. Kültürler D 12 - 14 arasında tedaviye hazırdır. Hücreler genellikle D 12'de %80 birleşiktir ve D 14 ile %100'e yakın birleşim olabilir. Tipik olarak, D 12'de, 12 oyuklu bir plakada oyuk başına yaklaşık 100.000 hücre vardır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Eagle's media'nın (DMEM) 4.5 g/L glikoz ile modifikasyonu	Fransa	12-709F	cDMEM ortamı standart, yaygın olarak kullanılan bir kültür ortamıdır. Bireysel araştırmacılar, DMEM'i ve cDMEM ortamını yapmak için kullanılan diğer tüm bileşenleri nereden satın alacaklarına karar verebilirler.
L-Glutamin (100x)	Fransa	17-605E	L-glutamin, çeşitli kültür ortamları için standart, yaygın olarak kullanılan bir bileşendir. Bireysel araştırmacılar L-glutaminin nereden satın alınacağına karar verebilirler.
Antibiyotik-Antimikotik Çözelti (100x)	Corning-Medya Teknolojisi	30-004-CI	Bu, 10.000 birim / mL penisilin G, 10 mg / mL streptomisin sülfat ve 25 μg / mL amfoterisin B içerecek şekilde formüle edilmiş bir penisilin, streptomisin ve Amfoterisin kombinasyonudur.
2-merkaptoetanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	M3148	Hücre kültürü, moleküler biyoloji ve elektroforez için uygun bir BioReagent.
Papain ayrışma sistemi	Worthington Biyokimya Şirketi	LK003150	Bu kitin ayrı bileşenleri ayrı olarak satın alınabilir.
Percoll Belediyesi	GE Sağlık Hizmetleri	17-0891-01	Percoll steril solüsyon olarak satılmaktadır. Seyreltilmemiş Percoll gerekirse yeniden otoklavlanabilir.
Laboratuvar hattı inkübatör/çalkalayıcı	Barstead/Laboratuvar hattı	MaxQ4000	Bu, şu anda sahip olduğumuz kuluçka makinesi/çalkalayıcıdır. Bunun yerine başka tür çalkalayıcılar kullanılabilir.

Gazetesi Serisi Serisi