Otik progenitör hücrelerin duyusal epitel hücrelerine farklılaşması ve ardından immün boyama

Özet

Kaynak: Azadeh, J. et al., Ölümsüzleştirilmiş Multipotent Otic Progenitör Hücrelerde Farklılaşmanın Başlatılması.J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, ölümsüzleştirilmiş multipotent otik progenitör (iMOP) hücrelerin duyusal epitel hücrelerine farklılaşmasını göstermektedir. Başarılı hücre farklılaşmasını doğrulamak için iMOP hücrelerinin kültürlenmesi, otosferlerin oluşturulması, farklılaşmanın indüklenmesi ve hücresel bileşenlerin ve farklılaşma belirteçlerinin floresan mikroskobu aracılığıyla görselleştirilmesiyle ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

1. IMOP Hücrelerinde Kendini Yenilemeyi Sürdürme

1. iMOP kültür ortamını hazırlayın: DMEM/F12, 1X B27 takviyesi, 25 μg/ml karbenisilin ve 20 ng/ml bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF). Steril reaktifler kullanarak 50 ml iMOP kültür ortamı yapın. 49 ml DMEM/F12'yi 37 °C'lik bir su banyosunda 50 ml'lik bir konik içinde ısıtın.
   1. 50X B27 takviyesi ve filtreyle sterilize edilmiş 100 mg / ml karbenisilin alikotlarını 37 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca çözdürün. RT'de 100 μg / ml bFGF alikotunu çözün. DMEM / F12'ye 1 ml 50X B27, 10 μl 100 μg / ml bFGF ve 12.5 μl 100 mg / ml karbenisilin ekleyin.
2. iMOP hücrelerini kültürlemek için 60 mm'lik bir doku kültürü kabında 3 ml ortam kullanın. Medya hacmini iki katına çıkararak her geçen gün kültürlere yeni medya ekleyin. bFGF konsantrasyonunun 5 ng/ml'nin altına düşmediğinden emin olun.
   1. iMOP hücrelerini 37 ° C'de% 5 CO ile kültürleyin_2. Aşağıdaki adımlarda listelendiği gibi 5-7 gün sonra kültürdeki geçiş hücreleri. 10 ml'lik bir pipet ucu kullanarak kültürü 15 ml'lik bir koniğe aktarın.
3. 0.1 ml 0.5 M EDTA pH 8.0'ı 50 ml HBSS'ye seyrelterek HBSS'de 1 mM EDTA yapın. 37 °C su banyosunda HBSS'de yapılan ön ısıtma 1 mM EDTA.
4. RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'da yerçekimi sedimantasyonu veya santrifüjleme ile hücreleri hasat edin. Yerçekimi sedimantasyonu için, kültürleri içeren 15 ml'lik konik malzemeyi 37 ° C'lik inkübatöre 5 - 10 dakika boyunca yerleştirin. Bu süreden sonra, otosferlerin 15 ml'lik koninin dibinde toplandığını gözlemleyin.
   not: Aşırı merkezkaç kuvveti hücre hasarına neden olabilir.
5. Hücre peletini bozmadan 2 ml'lik bir aspirasyon pipeti kullanarak kullanılmış ortamı dikkatlice aspire edin. Hücre peletine 0.5 ml önceden ısıtılmış 1 mM EDTA HBSS çözeltisi ekleyin. Bir P1000 pipeti kullanarak 2-3 kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Konik olarak 37 °C'ye yerleştirin ve tek hücrelere ayrışmayı kolaylaştırmak için <5 dakika inkübe edin.
6. Otosferlerin ayrışıp ayrışmadığını belirlemek için hücre çözeltisini hafifçe döndürün. Koninin dibine otosfer tortusu yoksa, hücreler ayrışır. Kuluçka süresi değişebilir.
   not: EDTA ile uzun süreli inkübasyon, aşırı hücre ölümüne neden olur.
7. Hücreleri 37 ° C'den çıkarın, EDTA'yı nötralize etmek ve seyreltmek için 2 ml ortam ekleyin. Hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleme ile toplayın. 2 ml'lik bir aspirasyon pipeti kullanarak seyreltilmiş EDTA'yı aspire edin ve hücreleri yıkamak için 5 ml 1X PBS ekleyin.
8. Hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün ve 2 ml'lik bir aspirasyon pipeti kullanarak 1X PBS'yi aspire edin. Hücreleri bir P1000 pipeti kullanarak 0,5 ml iMOP kültür ortamında 2-3 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
9. Uygun kasetlere sahip bir mikroakışkan parçacık sayacı kullanarak hücreleri sayın. iMOP hücrelerinin birleşik bir plakası ~ 6 X10⁶ hücre içerecektir. Hücreleri ortamda 1:100 oranında seyreltin ve sayım için kasete 75 μl hücre çözeltisi ekleyin. Plaka: 1 x 10⁶ hücre, 6 cm'lik bir tabakta, iMOP kültür ortamında (~1:10 seyreltme). Her 5 - 7 günde bir iMOP'ları geçiş.
   not: Büyük otosferler oluşturan veya doku kültürü kabının dibine yapışan hücreler farklılaşacaktır. Kültürler aşırı birleşikse hücreler de ölecektir.

2. IMOP Hücrelerini Duyusal Epitele Ayırmak

1. 50 ml iMOP duyusal epitel farklılaşma ortamı hazırlayın: DMEM/F12, 1X B27 takviyesi, 25 μg/ml karbenisilin. 50 ml iMOP duyusal epitel farklılaşma ortamı yapın. 49 ml DMEM/F12'yi 37 °C'lik bir su banyosunda 50 ml'lik bir konik içinde ısıtın. 50X B27 takviyesi ve 100 mg/ml karbenisilin alikotlarını 37 °C su banyosunda 5 dakika boyunca çözdürün. DMEM / F12'ye 1 ml 50X B27 ve 12.5 μl 100 mg / ml karbenisilin ekleyin.
2. Hücreleri toplamak, ayrıştırmak, yeniden askıya almak ve saymak için 1.4-1.9 arasındaki adımları yineleyin
3. Tabak 1 x 10⁶ cm'lik bir tabakta 6 hücre -3. günde iMOP kültür ortamı kullanılarak. 0. Günde, kültürleri 10 ml'lik bir pipet kullanarak 15 ml'lik bir konik içine aktarın. Otosferleri, adım 1.6'da belirtildiği gibi yerçekimi sedimantasyonu ile toplayın. 2 ml'lik bir aspirasyon pipeti kullanarak kullanılmış ortamı aspire edin ve otosferleri koninin altında bırakın.
4. Yavaşça 2 ml duyusal epitel farklılaşma ortamı ekleyin. Otosferleri 10 ml'lik büyük çaplı bir pipet kullanarak 6 cm'lik bir tabağa aktarın.
   not: Sert pipetlemeden kaynaklanan mekanik kesme, hücreleri otosferlerden ayırabilir.
5. Kültürlere her gün 2 ml taze duyusal epitelyal farklılaşma ortamı ekleyin. Gerekirse, hücreler yerçekimi sedimantasyonu ile toplanabilir ve ortam değiştirilebilir.
6. 10. günde otosferleri 15 ml'lik bir koniğe aktararak ve otosferlerin adım 1.6'da belirtildiği gibi çökelmesine izin vererek toplayın. Kullanılmış ortamı 2 ml'lik bir aspirasyon pipeti kullanarak aspire edin ve otosferleri rahatsız etmeyin.
7. RT'de 15 dakika boyunca 1X PBS'de% 4 formaldehit içinde inkübe ederek otosferleri sabitleyin. Formaldehit çözeltisini çıkarın ve otosferleri yıkama tamponu ile yıkayın (% 0.1 TritonX-100 içeren 1X PBS) 1 saat boyunca bloke tamponunda (% 10 normal keçi serumu ve% 0.1 Triton X-100 içeren 1X PBS) inkübe etmeden önce.
   1. Tamponu değiştirin ve numuneleri seyreltilmiş antikor ile bloke edici tamponda inkübe edin. 4 ° C'de inkübe edin. % 0.1 Triton X-100 içeren 1X PBS ile numuneleri yıkayın ve otosferi immün boyamaya tabi tutun. Otosferleri 1X PBS'ye aktarın ve otosferleri bir P1000 pipeti kullanarak bir cam slayt üzerindeki montaj ortamına yerleştirin. Numunenin üzerine bir lamel koyun ve montaj ortamının 4 °C'de kurumasını bekleyin.
8. 16 bit CCD kamera ve 20X 0.75 hava veya 40X 1.3 NA yağa daldırma objektifi ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kurulumu kullanarak epifloresan görüntüler elde edin. Listelenen (uyarma ve emisyon) dalga boylarını kullanarak farklı renk kanallarından floresan toplayın: mavi (377 ± 25 nm/447 ± 30 nm), yeşil (475 ± 25 nm/540 ± 25 nm), kırmızı (562 ± 20nm/ ve 625 ± 20nm) ve kızılötesi (628 ± 20nm/ ve 692 ± 20 nm).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 Kalınlık Cam Lamel (Yuvarlak 12 mm)	Elektron Mikroskobu Bilimleri	72230-01
DMEM/F12	Yaşam Teknolojileri	11320-082
Fosfat Tamponlu Tuzlu Serum Fizyolojik (PBS) pH 7.4	Yaşam Teknolojileri	10010-023
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Yaşam Teknolojileri	14025-092
B27 Takviyesi (50X) Serum İçermez	Yaşam Teknolojileri	17504-044	1 ml alikot olarak saklanır
Prolong Altın Antifade Mountant	Yaşam Teknolojileri	47743-736	10 mg / ml 100 μl alikot olarak saklanır
Moxi Z Mini Otomatik Hücre Sayacı	Orflo	MXZ001
Moxi Z Kaset Tipi S	Orflo	MXC002
Rekombinant Murin Fibroblast Büyüme Faktörü, bazik (bFGF)	Peprotech teknolojisi	450-33	H20'de% 0.1 BSA'da yeniden süspanse edildi ve 20 mg / ml alikotlar olarak saklandı
Karbenisilin, Disodyum Tuzu	Thermo Fisher Bilimsel	BP2648-1	10mM Hepes pH 7.4'te yeniden süspanse edilir ve 100 mg / ml alikot olarak saklanır
5 ml pipet ayrı ayrı sarılmış karton kapaklı (200/kutu)	Thermo Fisher Bilimsel	1367811D
10 ml pipet ayrı ayrı sarılmış karton kapaklı (200/kutu)	Thermo Fisher Bilimsel	1367811D
Doku Kültürü İşlem Görmüş 6 cm Tabak	Thermo Fisher Bilimsel	130181
TipOne filtre pipet uçları 0.1-10 ul uzatılmış filtre ucu	ABD Bilimsel	1120-3810
TipOne filtre pipet uçları 1-20 ul filtre ucu	ABD Bilimsel	1120-1810
TipOne filtre pipet uçları 1-200 ul filtre ucu	ABD Bilimsel	1120-8810
TipOne filtre pipet uçları 101-1000 ul filtre ucu	ABD Bilimsel	1126-7810
15 ml Konik Tüpler Steril 20 torba 25 tüp (500 tüp)	ABD Bilimsel	1475-0511
50 ml konik tüp steril 20 torba 25 tüp (500 tüp)	ABD Bilimsel	1500-1211