Ölümsüzleşmiş Multipotent Otik Progenitörlerin Spiral Ganglion Nöronlarına Ayrılması ve Farklılaşmanın Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Azadeh, J., et al. Ölümsüzleştirilmiş Multipotent Otic Progenitör Hücrelerde Farklılaşmayı Başlatma. J. Vis. Uzm. (2016).

Video, ölümsüzleştirilmiş multipotent otik progenitörlerin (iMOP'lar) spiral ganglion nöronlarına (SGN'ler) farklılaşmasını ve farklılaşmanın immünofloresan temelli doğrulanmasını göstermektedir. iMOP'lar, SGN'lere farklılaşma için bir nöronal farklılaşma ortamında kültür substratı kaplı lameller üzerine kaplanır. Farklılaşmış hücreler, nöronal farklılaşma belirteçlerine özgü antikorlarla etiketlenir ve farklılaşmayı doğrulamak için mikroskop altında analiz edilir.

Protokol

1. iMOP'tan Türetilen Nöronları Ayırt Etme

1. 50 ml nöronal farklılaşma ortamı yapın: Nörobazal ortam, 1X B27 takviyesi, 2 mM L-Glutamin. 50X B27 ve 200 mM L-Glutamin şişesini 37 °C su banyosunda 5 dakika çözdürün. 48.5 ml Nörobazal ortama 1ml 50X B27 ve 0.5 ml 200 mM L-Glutamin ekleyin.
2. Steril 10 cm'lik bir tabağa 12 mm yuvarlak 1,5 cam lamel yerleştirerek kaplayın ve lamelleri sterilize etmek için tabağa %70 etanol (EtOH) ilave edin ve temizleyin.
3. Etanol ile kaplandıklarından emin olmak için lamelleri hafifçe çalkalayın. Kalan etanolü yıkamak için lamelleri steril 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez durulayın. Kalan 1X PBS'yi yıkamak için lamel steril H₂O ile bir kez durulayın.
4. H 2O'yu2 ml'lik bir aspirasyon pipeti kullanarak aspire edin ve lamellerin kurumasını bekleyin. Lamelleri doku kültürü başlığında 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın. Lamelleri hemen kullanılmayacaksa steril bir ortamda saklayın.
5. 24 kuyulu bir tabağın her bir oyuğuna bir adet 12 mm'lik yuvarlak lamel yerleştirin. Lamellerin kuyunun dibinde düz durduğundan emin olmak için plakayı hafifçe sallayın.
6. 2 mg / ml poli-D-lizin stok çözeltisini oda sıcaklığında (RT) çözün ve 1X PBS'de 10 μg / ml poli-D-lizin konsantrasyonuna seyreltin. Kuyucuklara 0.25 ml 10 ug / ml poli-D-lizin ekleyin. Plakayı 37 °C inkübatörde 1 saat bekletin.
7. Kuyuları steril 1X PBS ile 3 kez yıkayın. RT'de 10 mg / ml laminin stok çözeltisini çözün ve 1X PBS'de 10 μg / ml'ye seyreltin. 0.25 ml 10 μg / ml laminin çalışma solüsyonunu 24 çok kuyulu bir tabağın tek bir oyuğuna ekleyin. Plakayı 37 °C inkübatörde inkübe edin. 2 ml'lik bir aspirasyon pipeti kullanarak laminin solüsyonunu aspire edin.
8. P1000 pipeti ile 1 ml 1X PBS ekleyerek ve 2 ml aspirasyonlu pipet ile aspire ederek 1X PBS'yi çıkararak lameli 1X PBS ile 3 kez yıkayın. Hücreler kaplanmaya hazır olana kadar kuyuda son yıkamadan itibaren 1X PBS bırakın. Hücreleri toplayarak, ayrıştırarak ve sayarak nöronal farklılaşmayı başlatın. Tabak 1 x 10 -3. günde 6 cm'lik bir tabakta⁶ hücre.
9. 0. Günde, hücreleri hasat edin, ayrıştırın ve sayın. 1 x 10⁵ - 1.5 x 10⁵ iMOP hücrelerini, 24 çok kuyulu bir tabakta oyuk başına 0.5 ml önceden ısıtılmış nöronal farklılaşma ortamına tohumlayın. Her gün kültürlere önceden ısıtılmış nöronal farklılaşma ortamını aspire edin ve ekleyin.
10. iMOP'tan türetilen nöronları %4 formaldehit içinde 15 dakika boyunca sabitleyin. 7. günde RT'de. Formaldehit çözeltisini çıkarın, iMOP türevi nöronları 1 saat boyunca bloke edici tamponda (% 10 normal keçi serumu ve% 0.1 Triton X-100 içeren 1X PBS) inkübe etmeden önce yıkama tamponu (% 0.1 TritonX-100 içeren 1X PBS) ile yıkayın.
    1. Tamponu değiştirin ve numuneleri seyreltilmiş antikor ile bloke edici tamponda inkübe edin. 4 °C'de inkübe edin. İmmün boyamaya maruz kalan hücreleri% 0.1 Triton X-100 içeren 1X PBS ile numuneleri yıkayın. Montaj ortamına yerleştirmeden önce kapak camını 1X PBS ile yıkayın. Epifloresan görüntüleri elde etmeden önce montaj ortamının 4 °C'de kurumasını bekleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 Kalınlık Cam Lamel (Yuvarlak 12 mm)	Elektron Mikroskobu Bilimleri 7	72230-01
DMEM/F12	Yaşam Teknolojileri	11320-082
Nörobazal Orta	Yaşam Teknolojileri	21103
Fosfat Tamponlu Tuzlu Serum Fizyolojik (PBS) pH 7.4	Yaşam Teknolojileri	10010-023
B27 Takviyesi (50X) Serum İçermez	Yaşam Teknolojileri	17504-044	1 ml alikot olarak saklanır
L-Glutamin (200 mM)	Yaşam Teknolojileri	25030-081	5 ml alikot olarak saklanır
Doğal Fare Laminin	Yaşam Teknolojileri	23017-015	1 mg / ml alikot olarak saklanır
Prolong Altın Antifade Mountant	Yaşam Teknolojileri	47743-736	10 mg / ml 100 μl alikot olarak saklanır
Moxi Z Mini Otomatik Hücre Sayacı	Orflo	MXZ001
Moxi Z Kaset Tipi S	Orflo	MXC002
Poli-D-Lizin	Sigma	P7886 Serisi	1X PBS'de yeniden süspanse edilir ve 10 mg / ml 100 μl alikot olarak saklanır
5 ml pipet ayrı ayrı sarılmış karton kapaklı (200/kutu)	Thermo Fisher Bilimsel	1367811D
10 ml pipet ayrı ayrı sarılmış karton kapaklı (200/kutu)	Thermo Fisher Bilimsel	1367811D
Doku Kültürü ile Tedavi Edilmiş Biolite 24 Kuyulu Plaka	Thermo Fisher Bilimsel	130188
Doku Kültürü Uygulanmış Biolite 6 Kuyulu Plaka	Thermo Fisher Bilimsel	130184
Doku Kültürü İşlem Görmüş 6 cm Tabak	Thermo Fisher Bilimsel	130181
EMD Millipore Millex Steril Şırınga PVDF Filtre Gözenek boyutu: 0.22 μm	Thermo Fisher Bilimsel	SLGV033RS
TipOne filtre pipet uçları 0,1 - 10 μl uzatılmış filtre ucu	ABD Bilimsel	1120-3810
TipOne filtre pipet uçları 1 - 20 μl filtre ucu	ABD Bilimsel	1120-1810
TipOne filtre pipet uçları 1 - 200 μl filtre ucu	ABD Bilimsel	1120-8810
TipOne filtre pipet uçları 101 - 1000 μl filtre ucu	ABD Bilimsel	1126-7810
15 ml Konik Tüpler Steril 20 torba 25 tüp (500 tüp)	ABD Bilimsel	1475-0511
50 ml konik tüp steril 20 torba 25 tüp (500 tüp)	ABD Bilimsel	1500-1211