Tüm hayvan modeli prosedürleri yerel kurumsal hayvan bakım komitesi tarafından gözden geçirilmiştir ve JoVE veteriner inceleme kurulu tüm hayvan modeli prosedürlerini gözden geçirmiştir.
1. Zamanlanmış eşleşmeler
- Yer ISLMN:GFP (Adacık Motor Nöron Yeşil Floresan Proteini; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Stok No: 017952) erkek ve dişi fareler gece boyunca birlikte. Çiftleşmeden önce dişileri tartın ve ağırlıkları kaydedin.
NOT: ISLMN:GFP, motor nöronları özellikle sitotoksik olmayan, motor nöronların ve aksonlarının hücre zarına lokalize olan ve gelişim sırasında sinirlerin görüntülenmesine izin veren farnesile edilmiş bir GFP ile etiketler. Diğer floresan etiketli hatlar da kullanılabilir.
- Sabahın erken saatlerinde vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin. Bir fişin tanımlandığı tarih E0.5 olarak belirlenmiştir.
- Embriyonik gün 10.5'te (E10.5) kilo alımı ve / veya ultrason kullanarak hamileliği onaylayın. Hamile barajlar en az 1 g kazanmış olmalıdır. Embriyolar E10.5'te ultrasonda görülebilir.
2. Dilim kültürü için reaktiflerin ve vibratomun hazırlanması
- 500 mL dilimleme tamponu hazırlayın: 5 mL HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit) ve 5 mL penisilin / streptomisin ekleyin. 4 °C.
'ye soğutun
not: Ekstra dilimleme tamponu 4 °C'de saklanmalıdır ve gelecekteki dilim kültürü deneyleri için kullanılabilir.
- 50 mL kültür ortamı hazırlayın: Steril bir başlıkta 12.5 mL HBSS, 12.5 mL fetal sığır serumu (FBS), 250 μL glikoz, 250 μL L-glutamin, 125 μL HEPES ila 24.4 mL Florobright DMEM (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı) ekleyin. (Nihai konsantrasyonlar:% 25 HBSS,% 25 FBS,% 0.5 glikoz, 1 mM glutamin ve 2.5 mM HEPES içeren FlouroBright DMEM.). Kültür ortamını steril bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.
not: Kültür ortamı 4 °C'de 3 haftaya kadar saklanabilir.
- Steril bir başlıkta, 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1,5 mL kültür ortamı ekleyin. Her oyuğa bir hücre kültürü eki (Malzeme Tablosu) ekleyin. Steril 37 °C ve% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
- % 4 düşük erime sıcaklığına sahip agaroz hazırlayın: 2 g düşük erime sıcaklığına sahip agarozu 50 mL steril PBS içinde çözün. Tamamen eriyene kadar 30-60 s aralıklarla mikrodalgada pişirin. Sıvıyı tutmak için 40 °C su banyosuna koyun.
not: Ekstra agaroz oda sıcaklığında (RT) saklanabilir ve gelecekteki dilim kültür deneyleri için eritilebilir.
- Vibratomu ayarlayın: Vibratomun üzerine yeni bir bıçak yerleştirin. Ayarları kontrol edin: kalınlık 400-450 μm. Vibratom aşamasını önceden soğutun. Dış hazneye biraz buz koyun. Canlı dilimlere ayrılmış bir oda ve sahne kullanın. Artık fiksatif dilimlere zarar verebileceğinden, sabit doku için aynı vibratom odasını kullanmayın.
- Mikroskop aşaması üst inkübatörünü 37 °C ve% 5 CO2'ye hazırlayın.
- Diseksiyon için hazırlanın: Cerrahi aletleri temizleyin ve% 70 etanol ile püskürtün. İki Petri kabını HBSS ile doldurun, buzun üzerine yerleştirin. 12 oyuklu bir doku kültürü plakası açın ve kapağı alt tarafı yukarı bakacak şekilde buzun üzerine yerleştirin. 6 oyuklu bir doku kültürü plakası açın ve her oyuğa hücre kültürü membran eklerini ve 1.5 mL hücre kültürü ortamını yerleştirin. Plakayı 37 °C ve %5 CO2 inkübatörde önceden ısıtın.
3. E10.5 embriyolarının toplanması ve dilimlerin hazırlanması
>NOT: Bu noktadan sonraki tüm adımlar mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Embriyoları her zaman buz üzerinde tutun.
- Hamile barajı (E10.5) bir CO2 odasında ötenazi yapın. Servikal çıkık gerçekleştirin.
- Karnınıza% 70 etanol püskürtün. Karnı makasla kesin, rahmi çıkarın ve kanı hızlı bir şekilde yıkamak için buz gibi HBSS'li bir Petri kabına yerleştirin. Yıkanmış uterusu bulaşık buz gibi soğuk HBSS ile doldurulmuş ikinci bir Petri'ye taşıyın.
- Bir diseksiyon kapsamı altında, embriyoları uterus boynuzundan ve tek tek amniyotik keselerden çıkarın. Embriyoları 12 oyuklu bir plakanın kapağının alt tarafına yerleştirin. Buz üzerinde tutun.
- Bir diseksiyon kapsamı altında, her embriyoyu çevreleyen sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdı kullanın.
not: Embriyolar dokunulduğunda filtre kağıdına yapışacaktır.
- Embriyoları agaroza gömün. Örtmek için her embriyonun üzerine erimiş agaroz dökün. Buz üzerinde tutun. Agaroz sertleşir sertleşmez, her bir embriyoyu çevirin ve diğer tarafa ilave agaroz dökün. Buz üzerinde tutun.
- Floresan bir diseksiyon dürbünü kullanarak, her embriyonun etrafındaki agarozu kesin, böylece vibratom aşamasına yapıştırıldığında düzgün bir şekilde yönlendirilecektir. Okülomotor çekirdek ve erken akson büyümesi floresandır. Embriyoyu, çekirdek, büyüyen aksonlar ve göz bir çizgi oluşturacak şekilde hizalayın ve agarozu bu çizgiye paralel kesilmiş bir tıraş bıçağıyla kesin (embriyonun sırtı, bkz. Şekil 1A).
not: Bu, vibratom aşamasına yapıştırılan taraf olacaktır (embriyo, başı vibratom bıçağına en yakın olacak şekilde sırt üstü konumlandırılacaktır). Okülomotor çekirdek ile göz arasındaki bir çizgi vibratom bıçağına paralel olmalıdır.
- Vibratom haznesini buz gibi soğuk dilim tamponu ile doldurun. Embriyoyu vibratom aşamasına süper yapıştırın, böylece bıçak okülomotor çekirdeğe ve gözlere paralel olacaktır. Süper yapıştırıcı kuruduktan sonra, embriyo bıçaktan uzağa bakacak şekilde yönlendirilecek şekilde vibratom aşamasını daldırın.
- 400-450 μm'lik dilimler halinde dilimleyin. Her dilimi steril bir transfer pipeti ile toplayın. Soğuk dilimleme tamponuna yerleştirin.
- Diseksiyon kapsamı altında, okülomotor çekirdekleri ve gözleri içeren dilimi seçin. Steril bir transfer pipeti kullanarak, 6 oyuklu plakadaki hücre kültürü ekine yerleştirin. Plakayı 37 °C inkübatöre geri koyun. Alternatif olarak, bir kişinin dilimlemesini ve diğerinin dilimleri yerleştirmesini sağlayın. Dilimleme ve inkübatöre yerleştirme arasındaki süreyi en aza indirin.
not: Dilimler, çekirdeklerden ve aksonlardan yayılan maksimum floresan görüntüleme mikroskobu objektifine en yakın olacak şekilde yönlendirilmelidir. Ters çevrilmiş bir mikroskopta, dilimler, plakanın altındaki hedefe en yakın çekirdek ve aksonlar ile zar üzerine yerleştirilmelidir.
- Kalan agarozu vibratom aşamasından çıkarın, bir sonraki embriyoyu sahneye süper yapıştırın ve tüm embriyolar dilimlenene ve kaplanana kadar 3.7-3.9 adımlarını tekrarlayın.
- Bir doz-yanıt eğrisi oluşturmak için her bir oyuktaki ortama inhibitör veya rekombinant molekül ekleyin. Uygun çözücü içinde seyreltin.
not: Dimetil sülfoksit (DMSO) kullanılıyorsa, yalnızca doku kültürü sınıfı DMSO kullanın. Alternatif olarak, protein salınımlı boncuklar dilim üzerinde belirli yerlere yerleştirilebilir.
- 37 °C ve% 5 CO2 haznesine mikroskoba yerleştirin. Mikroskobu, her dilimin faz kontrastı ve floresan fotoğraflarını her 30 dakikada bir (veya istenirse daha sık) çekecek şekilde ayarlayın. Dilimler 48-72 saat muhafaza edilebilir.
