Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Aletlerin, Çözeltilerin ve Ortamın Hazırlanması
Not: Protokolde bildirilen malzemeler, reaktifler, araçlar ve aletlerle ilgili tüm bilgiler Malzeme Tablosunda belirtilmiştir.
- Tüm diseksiyon aletlerini otoklavlayın ve steril bir alanda saklayın. Aşağıdaki aletleri kullanın: 4 standart forseps (2 uzun ve 2 kısa) ve 2 makas, ayrıca diseksiyon için 2 forseps (1 uzun ve 1 kısa) ve 1 makas; Yedek olarak fazladan bir set bulundurun.
- Yıkamalar, immünoetiketleme prosedürleri ve hücre sıralama adımları sırasında kullanmak için 100 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) /% 1 fetal sığır serumu (FBS) çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 4 °C.
°C'de soğuk tutun
not: Canlı hücreler için toksik olabileceğinden çözeltiye sodyum azid (NaN3) eklemeyin.
- 99 mL PBS ve 1 mL FBS ile 100 mL PBS /% 1 FBS hazırlayın.
- Toplama ve kültür ortamı olarak kullanılmak üzere% 3 FBS ile desteklenmiş 100 mL steril nöral hücre ortamı hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Hücre kültürünü 4 °C'de steril tutun. Kullanmadan önce sadece oda sıcaklığına (RT) ısıtın.
- 97 mL nöral hücre ortamı ve 3 mL FBS kullanarak% 3 FBS ile desteklenmiş 100 mL nöral hücre ortamı hazırlayın.
- Ön soğutma toplama tüpleri (15 mL tüpler), bir buz kovasına yerleştirilerek 5 mL toplama ortamı ile önceden kaplanmıştır. Hücrelerin tüp yüzeyine yapışmasını önlemek için sadece polipropilen tüpler kullanın.
- Biyogüvenlik kabinine 40 mm'lik tabaklar, 70 μm'lik naylon süzgeçler, şırıngalar, hücre süzgeci için tokmaklar ve steril polipropilen tüpler yerleştirin. Prosedürlerden önce tüm öğeleri sterilize edin ve prosedürler boyunca steril bir şekilde muhafaza edin.
not: Retinanın toplanmasından sonraki tüm adımlar biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilecektir.
2. Retina Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması
- Kornea diseksiyonuna başlamak için toplanan gözü bir diseksiyon mikroskobunun taban plakasına yerleştirin. Her gözü ayrı ayrı inceleyin.
- Forseps kullanarak küreyi optik sinir tabanında dikkatlice tutun. Bu adım için bir uzun ve bir kısa standart forseps kullanın.
- Korneayı delmek için 30 gauge (30G) keskin bir iğne kullanın. Bu, sulu mizahın gözden tahliye edilmesine izin verecek ve gözü forseps ile tutmayı kolaylaştıracaktır.
- Korneayı forseps ile tutun ve korneada küçük bir kesi yapmak için makas kullanın. Forseps kullanarak kornea ve sklerayı nazikçe soyun. Küre yarıya kadar soyulduğunda, retinayı açın ve forsepsleri kullanarak lensi dışarı çıkarın. Kornea, sklera ve lensi atın.
not: Bu yöntem, retinanın gözün geri kalanından tamamen ayrılmasını sağlar.
- Retinayı PBS/1% FBS.
not: Petri kabına alternatif olarak, bir hücre kültürü kabı kullanılabilir. Fizyolojik koşullarda olduğu gibi retinayı her zaman nemli tuttuğunuzdan emin olun.
- Her retinayı biyogüvenlik kabini içinde taze steril PBS/%1 FBS ile üç kez yıkayın.
- PBS/%12 FBS ile nemlendirilmiş steril 70 μm'lik bir naylon süzgecin üzerine 1 adede kadar retina yerleştirin. 10 mL'lik bir şırınganın arka ucunu kullanarak, hücreleri ayırmak için dairesel bir hareket kullanarak retinayı nazikçe yumuşatın.
- Alternatif olarak, hücre süzgeci maserasyonu için bir havaneli kullanın veya 37 ° C'de 15 dakika boyunca 15 IU / mL papain, 5 mM L-sistein ve 200 U / mL DNaz I kombinasyonu ile enzimatik sindirim kullanın, ardından PBS /% 10 FBS ile inaktivasyon < / >
not: Enzimatik sindirim, şırınganın arka ucu veya havaneli ile maserasyon ile karşılaştırıldığında, geri kazanılan hücrelerin yüzdesinde herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir.
- İzole edilmiş hücreleri aktarmak için steril 70 μm naylon süzgeci polipropilen toplama tüpünün üzerine yerleştirin. Toplanan hücreleri bir P1000 pipeti kullanarak süzgeçten geçirin. Kalan hücreleri serbest bırakmak ve bunları toplama tüpüne aktarmak için süzgeci (adım 3.6) PBS/%1 FBS ile durulayın.
- Retina başına 1 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için PBS /% 1 FBS ekleyin. Hücre süspansiyonunu 200 x g ve RT.
'de 7 dakika santrifüjleyin
Not: Masere retina sayısına (< 6 retina) bağlı olarak, hücre peleti görülemeyecek kadar küçük olabilir.
- Hücre süpernatanını atın ve 5 retina başına 1 mL'lik bir oran kullanarak hücre peletini PBS /% 1 FBS'de yeniden süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
- Bir cam hemositometre ve lamel %70 alkol ile temizleyin. Retina hücresi süspansiyonunun eşit olarak dağıldığından emin olmak için hücreleri içeren tüpü hafifçe döndürün. 20 μL% 0.4 tripan mavisini bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 20 μL hücre süspansiyonu ile karıştırın.
- Yavaşça karıştırın ve% 0.4 tripan mavisi / hücre süspansiyon karışımının 10 μL'sini hemositometreye uygulayın ve her iki odayı da doldurun; kılcal hareket, %0.4 tripan mavisi / hücre süspansiyon karışımını lamel altına çekecektir. Bir mikroskop kullanarak, tüm tripan mavisi negatif hücreleri sayın; Bu sayı canlı hücreleri temsil eder.
- Aşağıdaki formülü kullanarak hücre canlılığını belirleyin: canlı hücre sayısı / toplam hücre sayısı =% canlılık.
not: Hücrelerin canlılığı %95'ten azsa, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) sırasında hücre canlılığını ayırt etmek için bir floresan boya gereklidir.
- Canlı hücrelere dayanıklı olmayan bir floresan canlılık boyası kullanın. Serum kalıntılarını gidermek için hücreleri PBS ile yıkayın. 100 μL'lik bir son hacimde 5.0 x 106 hücre başına hücre canlılığı ayrımı için 1 μL floresan boya ekleyin. Işıktan korunarak RT'de 15 dakika inkübe edin. PBS/%1 FBS hacminin 10 katını ekleyin. 200 x g ve RT'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Gerekirse, hücre süspansiyonunu gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Bu yapılırsa, hücre süspansiyon tüpünü PBS /% 1 FBS yerine nöral hücre ortamı ile doldurun. Tüpü yatay olarak yerleştirin ve 4 °C'de tutun.
3. Retina Hücrelerinin İmmün Olarak Etiketlenmesi
- Hücre sayısı başına antikor hacmini belirlemek için aşağıdaki dönüşümü kullanın: 100 μL'lik bir hacimde 5.0 x 106 hücre başına 2 μL antikor.
- Hücreleri yıkayın ve PBS /% 1 FBS'de tutun. Sıralama kurulumu sırasında negatif kontrol (etiketlenmemiş) olarak kullanmak için küçük bir hücre alikotu (5.0 x10 6 hücre) alın.
not: Bu negatif kontrol, hücre sıralayıcının uygun kalibrasyonu için kritik öneme sahiptir.
- Antikorların Fcγ reseptörleri II ve III'ü eksprese eden hücrelere spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmek için, PBS /% 1 FBS kullanarak 50 μL'lik bir nihai hacimde 1.0 x 106 hücre başına 1 μL bir anti-fare CD16 / 32 antikoru ekleyin. RT'de 10 dakika inkübe edin.
- Antikor kokteylini numuneye ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. Bir buz kovasında 30 dakika inkübe edin. Etiketli floroforların foto-ağartılması nedeniyle ışık deneyi tehlikeye atabileceğinden, buz kovasının üzerinin kapalı olduğundan emin olun.
- Aşağıdaki floresan etiketli anti-fare antikorlarını kullanarak antikor kokteylini hazırlayın: CD90.2 AF (Alexa fluor) -700, CD48 PE (Fikoeritrin) -Siyanin7, CD15 PE ve etiketsiz CD57.
Not: Her antikor için, 5.0 x 106 hücre başına aşağıdaki konsantrasyonları kullanın: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-Siyanin7, 0.4 μg; CD15 PE, 0.02 μg; ve etiketsiz CD57, 0.4 μg.
- Aşağıdaki hesaplamalara göre hacimleri kullanın (Malzeme Tablosunda listelenen ticari olarak mevcut antikorlara dayanarak): etiketlenecek toplam 5.0 x 107 hücre; 5.0 x 106 hücre başına 2 μL = her antikorun 20 μL'si; 4 farklı antikor = 80 μL antikor kokteyli; son hacim = [(5.0 x 107 toplam hücre)/5.0 x 106 hücreler] x 100 = 1.000 μL; 80 μL ABS + 50 μL anti-fare CD16/32 + 870 μL PBS/%1 FBS = 1.000 μL.
not: Bu kombinasyon, cihaz konfigürasyonu için en uygun florokrom kombinasyonunu sağladı. Aşağıdaki parametreler emisyonu ve uyarımı özetler: AF-700, 638 nm kırmızı diyot lazerle uyarıldığında 719 nm emisyon; PE-Siyanin7, 488 nm mavi diyot lazerle uyarıldığında 767 nm emisyon; ve PE, 575 nm mavi diyot lazerle uyarıldığında 488 nm emisyon.
- 30 dakikalık inkübasyondan sonra, PBS /% 1 FBS kullanarak hacmi 5 mL'ye getirin. Numuneleri 200 x g ve RT'de 7 dakika santrifüjleyerek yıkayın. Tüm bağlanmamış antikorları çıkarmak için prosedürü bir kez tekrarlayın.
- 5.0 x 106 hücrenin CD57'sini bağlayacak olan 2 μL ikincil antikor (0.1 μg) ekleyin. Adım 3.4'teki gibi bir buz kovasında 30 dakika inkübe edin. Hücreleri adım 3.5'teki gibi iki kez yıkayın.
- Adım 3.4.
'de etiketlenmemiş bir birincil antikor kullanılmışsa, hücreleri ikincil bir antikorla etiketleyin
Not: Bu konfigürasyon için tercih edilen ikincil antikor, Malzeme Tablosunda listelenmiştir; 421 nm emisyon dalga boyuna sahiptir. 405 nm'de mor diyot lazer ile uyarıldığında 450/50 nm'lik bir bant geçiren filtre ile kullanın.
- Aşağıdaki hesaplamalara göre hacimleri kullanın (Malzeme Tablosunda listelenen ticari olarak temin edilebilen antikora dayanarak): 5.0 x 106 hücre başına 2 μL = 20 μL ikincil antikor; son hacim = [(5.0 x 107 toplam hücre)/5.0 x 106 hücre] x 50 = 500 μL; 20 μL ABS + 480 μL PBS/%1 FBS = 500 μL.
- Etiketli hücreleri PBS/%1 FBS'de tutun. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın; 3.0 - 4.0 x 107 hücre / mL.
nihai retinal hücre konsantrasyonu kullanın
not: Hücreleri seyreltmek için hücre kültürü ortamı kullanmayın, çünkü fenol kırmızısı otofloresansı artırabilir, böylece negatif ve pozitif hücreler arasındaki çözünürlüğü azaltabilir. Hacim başına nihai hücre konsantrasyonu, büyük ölçüde cihaz konfigürasyonunun hacimsel akış hızına bağlıdır.
- Floresan yayılmasını en aza indirmek için kurulum sırasında tek renkli kontroller kullanın.
not: Kompanzasyon olarak da bilinen bu adım, floroforların kombinasyonu ile oluşan gürültüyü düzeltmek için uygulanır. Birden fazla türden floresan etiketli immünoglobulin (Ig) izotiplerini bağlama kapasitesine sahip PBS/%0.1 BSA/2 mM NaN3'teki polistiren mikroküreler, kompanzasyonu ayarlamak için pozitif kontroller sağlar.
- 3 damla polistiren mikrokürecikleri, florofor başına bir tane olacak şekilde steril FACS tüplerine yerleştirin. Her tüpe 1 μg ilgili florofor ekleyin. RT'de ışıktan korunarak 15 dakika inkübe edin. Numune tüplerine 3 mL PBS /% 1 FBS ekleyin. 200 x g ve RT'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 250 μL PBS /% 1 FBS'de yeniden süspanse edin.
- Negatif kontrolleri ayarlamak için, Ig'ye bağlanmayan polistiren mikro küreler kullanın. Gerekirse, bu adımı bir gün önce gerçekleştirin.