$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
>NOT: Kısaca fibroblastlar, mRNA tabanlı genetik yeniden programlama yoluyla iPSC'ye yeniden programlandı. iPSC'ler kök hücre ortamında (SCM) tutuldu (malzeme listesine bakınız) ve 1 mL SCM, rho ile ilişkili protein kinaz inhibitörü (ROCKi) Y-27632 ile 10 μM ve %10 (h/h) dimetil sülfür (DMSO) ile ~ 1.2 x 102 hücre / mL yoğunlukta saklandı. Aşağıdaki prosedürlerin tümü, aksi belirtilmedikçe bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.
1. Bazal membran matris seyreltme ve plaka kaplama
- Fenol kırmızısı içermeyen Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda (DMEM) Engelbreth-Holm-Swarm tümöründen saflaştırılan seyreltik (1:50) büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi.
- Hücre kültürü plakalarını uygun miktarda seyreltilmiş bazal membran matrisi ile kaplayın (yani, 6 oyuklu plaka = 1 mL, 12 oyuklu plaka = 0.5 mL) ve bu plakaları 37 ° C'de en az 1 saat inkübe edin.
2. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC) bakımı
NOT: 6 oyuklu düz tabanlı bir plakada kuyucuk başına maksimum birleşme ~1,2 x 106 hücredir.
- Dondurularak saklanmış iPSC'leri 10 μM Y-27632 ile SCM'ye çözün ve seyreltilmiş büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi ile kaplanmış 6 oyuklu bir plaka üzerine plakalayın.
- Çözüldükten sonraki ilk 24 saat boyunca 10 μM Y-27632 ile SCM'de iPSC'leri koruyun. 24 saat sonra taze ortama geçin.
- Hücreler geçmeden önce %80-90 birleşmeye ulaşana kadar iPSC'leri SCM'de tutun.
- Farklılaşma için istenen yoğunluğu (15.600 hücre/cm2) kuyunun yüzey alanıyla çarparak farklılaşma için kaç iPSC'ye ihtiyaç duyulacağını hesaplayın. 6 oyuklu düz tabanlı bir plaka için, 15.600 hücre/cm2 ile 9.6cm2'yi çarparak toplam 149.760 hücre/kuyu elde edin.
- Geçmek için hücreleri Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBBS) ile yıkayın. Ardından, hücreleri enzimatik olmayan etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (malzeme listesine bakın) ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Hücreleri nazikçe kaldırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücreleri taze SCM'de toplayın.
- Hücreleri seyreltilmiş SCM ile kaplanmış hücre kültürü plakaları üzerine plakalayın ve hücreleri adım 2.3'te tarif edildiği gibi koruyun veya bunları 1 mL SCM, 10 μM Y-27632 ve %10 DMSO'da ~ 1.2 x10 6 hücre / mL'de saklayın (h/h) -160 °C sıcaklıkta sıvı nitrojen içinde dondurularak saklanmış şişelerde.
3. iPSC'lerin BMEC'lere farklılaşması
NOT: Enzimatik olmayan EDTA, hücreleri kümelere ayırır. Enzimatik EDTA (Malzeme Tablosuna bakınız) hücreleri tek hücre süspansiyonuna ayırır. Retinoik asit (RA) ışıktan korunmalıdır.
- iPSC'leri Dulbecco'nun Fosfat Tampon Tuzlu Suyu (DPBS) ile bir kez yıkayın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 37 ° C'de yaklaşık 5 dakika boyunca enzimatik EDTA (6 oyuklu plaka için 1 mL, 12 oyuklu plaka için 0.5 mL ve 24 oyuklu plaka için 0.25 mL) ile inkübe edin.
- Hücreleri toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da (bağıl merkezkaç kuvveti) santrifüjleyin. 10 μM Y-27632 içeren SCM'de hücre peletlerini yeniden süspanse edin.
- Tripan Blue ve otomatik hücre sayacı veya bir hemositometre cihazı kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin. 24 saat boyunca 10 μM Y-27632 içeren SCM'de 6 oyuklu düz tabanlı bir plakanın (9.6 cm2/kuyucuk yüzey alanına sahip) 15.600 hücre/cm2 veya 149.760 hücre/kuyu yoğunluğunda plaka hücreleri.
- SCM'yi E6 ortamına değiştirerek 24 saat sonra farklılaşmayı başlatın. Önümüzdeki 4 gün boyunca E6 ortamını günlük olarak değiştirin.
- Farklılaşmanın 4. gününde, E6 ortamını seyreltilmiş (1:200) B27 takviyesi, 20 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve 10 μM RA ile takviye edilmiş insan endotelyal serumsuz ortam (hESFM) ile değiştirin. Önümüzdeki 48 saat boyunca bu ortamı değiştirmeyin.
- Seyreltilmiş (1:200) B27 ile 200 mL hESFM hazırlayın, 1 mL 50x konsantre B27 takviyesini 199 mL hESFM ile karıştırın.
- 200 μg/mL stok çözeltisi yapmak için 250 μL Tris tamponunda (5 mM Tris, pH 7.6, 150 mMsodyum klorür, NaCl) 50 μg bFGF'yi sulandırarak 20 ng/mL bFGF hazırlayın. 20 μL 200 μg/mL bFGF'yi 200 mL hESFM ile karıştırarak 20 ng/mL bFGF içeren 200 mL hESFM hazırlayın.
- Önce 100 mg RA tozuna 2.5 mL DMSO ekleyerek 40 mg / mL RA stok çözeltisi yaparak 10 μM RA hazırlayın. 10 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için bu konsantrasyonu 3 mg / mL'ye seyreltin. 200 μL 10μM RA'yı 200 mL hESFM'de karıştırarak 10 μM RA içeren 200 mL hESFM hazırlayın.
>4. iPSC'den türetilmiş BMEC'in saflaştırılması için kollajen IV (COL4) ve fibronektin (FN) matrisinin kaplanması
- 1 mg / mL FN stok çözeltisi yapmak için 2 mg FN'ye 2 mL steril su ekleyin. 1 mg / mL COL4 stok çözeltisi yapmak için 5 mg COL4'e 5 mL steril su ekleyin.
- FN'nin 37 °C'de en az 30 dakika çözünmesine ve COL4'ün oda sıcaklığında çözünmesine izin verin.
- FN stok çözeltisini steril suda 100 μg/mL'lik nihai konsantrasyona ve COL4 stok çözeltisini 400 μg/mL'lik nihai konsantrasyona seyreltin.
- İstenilen plakaları (6 oyuklu plaka = 1 mL COL4 / FN çözeltisi, 12 oyuklu plaka = 0.5 mL, 24 oyuklu plaka = 0.25 mL ve 12 oyuklu filtrelenmiş plaka = 0.25 mL) 400 μg / mL COL4 ve 100 μg / mL FN karışımı ile kaplayın.
- Plakaları en az 2 saat veya gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin; Transwell filtreli plakalar için en az 4 saat önerilir.
5. iPSC'den Türetilmiş BMEC'lerin alt kültürü ve saflaştırılması
NOT: Enzimatik EDTA ile inkübasyon, farklılaşmanın 6. gününde hücrelerin birleşmesine bağlı olarak 15 dakikadan uzun sürebilir.
- Farklılaşmanın 6. gününde, hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. Tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar 37 ° C'de en az 15 dakika boyunca 1 mL enzimatik EDTA ile inkübe edin.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla toplayın. Seyreltilmiş (1:200) B27 takviyesi, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM RA ile taze hESFM ile hücre peletlerini yeniden süspanse edin.
- 400 μg/mL COL4 ve 100 μg/mL FN karışımı ile kaplanmış plakalar üzerine tohum hücreleri. 6 oyuklu bir plakanın 1 oyuğuna 12 oyuklu bir plakanın 3 oyuğuna, 12 oyuklu filtrelenmiş bir plakanın 3 oyuğuna veya 24 oyuklu bir plakanın 6 oyuğuna oran kullanan tohum hücreleri.