$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Malzeme Kurulumu
- Civciv yumurtalarını piyasada bulunan bir masa üstü yumurta kuluçka makinesinde 37 ° C'de kuluçkaya yatırın. E7 embriyoları için yumurtaları 7 gün kuluçkaya yatırın.
- Çok elektrotlu dizileri (MEA'lar) hazırlayın. Gerekli sayıda MEA'yı 3 ila 4 saat boyunca %70 etanole batırarak ve ardından biyogüvenlik seviye-II (BSLII) davlumbazında yaklaşık 10 mL steril damıtılmış suda üç kez durulayarak sterilize edin.
not: MEA'lar, 8 x 8'lik bir ızgarada düzenlenmiş 64 nano gözenekli platin elektrot içerir. Elektrot çapı 30 μm'dir ve elektrotlar arasındaki boşluk 200 μm'dir. MEA'ları sterilize etmek için denatüre etanol kullanmayın, çünkü bu korozyona yol açacaktır.
- MEA'ları kapaklı steril bir kabın içine yerleştirin (steril koşulları korumak için) ve bir masa üstü inkübatöre taşıyın. 55 °C'de en az 6 saat pişirin. Bu adım, uygun sterilizasyon için kritik öneme sahiptir ve sıcaklık 60 °C'yi geçmemelidir. Steriliteyi korumak için, MEA'ları içeren kabı daha fazla kullanıma kadar saklamak üzere BSLII davlumbazına taşıyın.
not: Plastik kapaklı fırına dayanıklı bir cam pişirme kabı kullanıyoruz ve yüzeyini %70 etanol ile sterilize ediyoruz ve kuruması için BSLII davlumbazına yerleştiriyoruz.
- Hücre dışı matris (ECM) çözeltisini alikot. Şişeyi gece boyunca 4 ° C'de çözün ve 100 μL'lik alikotları -20 ° C'de dondurun.
not: ECM donmuş olarak gönderilir. Oda sıcaklığında polimerize olduğu ve polimerize olduktan sonra kaplanması imkansız olduğu için kaplamaya hazır olana kadar oda sıcaklığına getirilmemelidir. Bilinmeyen faktörlere bağlı ek etkileri önlemek için büyüme faktörü olmayan ECM tercih edilir.
- Tüm diseksiyon aletlerini (Dumont #5 forseps, kavisli forseps, küçük makas ve yaylı makas) ve kendinden sızdırmaz malzeme kaplı diseksiyon kaplarını %70 etanol ile sterilize edin ve diseksiyon başlığında kurumaya bırakın.
2. Civciv Embriyonik Nöron Kültürü ve Ağ Aktivitesi
- Kaplama gününde, -20 °C'lik dondurucudan bir şişe ECM'yi çıkarın, %70 etanol püskürtün ve buzun üzerine yerleştirin. BSLII başlığının içine 300 μL soğuk nörobazal ortam ekleyerek %25'e seyreltin.
- Bir P200 pipetteman kullanarak, elektrotlara dokunmamaya dikkat ederek MEA'nın merkezine 100 μL %25 ECM ekleyin ve yüzeyde ince bir film bırakarak hemen çıkarın. MEA'yı örtün ve nöronları kaplamaya hazır olana kadar CO2 inkübatörüne (37 ° C ve% 5 CO2) yerleştirin.
- Bir E7 yumurtasının dış kabuğunu (embriyonik gün 7, 37 ° C'de 7 gün boyunca inkübe edilmiş)% 70 etanol ile sterilize edin. Embriyoyu, kalsiyum içermeyen soğuk steril Hank'in Dengeli Tuzlar Çözeltisi (HBSS) içeren bir Sylgard alt diseksiyon kabına dekapite edin. Göz çevresini kesin ve gözbebeklerini çıkarın. DuMont #5 ince forseps ve yaylı makas kullanarak ventral tarafta bir kesi yapın ve ön beyni ve optik tektumu ortaya çıkarmak için cildin dış katmanlarını çıkarın. Piyal zarı dikkatlice soyun ve çıkarın. Ön beyni başka bir petri kabına aktarın ve yaylı makasla yaklaşık 2 mm'lik küçük parçalar halinde kesin.
not: Piyal zar çıkarıldıktan sonra ön beyne bağlı herhangi bir kan damarı olmamalıdır. Mümkünse, diseksiyonun steril bir diseksiyon başlığında yapılması tercih edilir, ancak aletler ve diseksiyon alanı %70 etanol ile iyice sterilize edildiği sürece diseksiyon bir başlık dışında yapıldığında oldukça iyi sonuçlar elde ettik.
- Steril bir transfer pipeti kullanarak, ön beyin parçalarını 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve santrifüj tüpünün dibine batmalarına izin verdikten sonra mümkün olduğunca HBSS'yi çıkarın.
- 1 mL %0.05 tripsin/etilendiamin tetraasetik asit (Tripsin/EDTA) (37 °C'ye önceden ısıtılmış) ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
- Bir Pasteur pipeti kullanarak, doku parçalarını rahatsız etmeden tripsini dikkatlice çıkarın ve 1 mL nörobazal ortam ekleyin. Doku parçalarının dibe çökmesine izin verin ve ortamı çıkarın. Bu yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Bu adım, tripsin / EDTA'yı yıkamak içindir.
- 2 mL nörobazal ortam ekleyin ve ezmeye başlayın. Öğütme, steril bir ateşle parlatılmış Pasteur pipetinin alınmasını ve daha fazla parça görülmeyene kadar dokuyu birkaç kez nazikçe geçirmeyi içerir. Tekrarlanan geçişlerden sonra herhangi bir parça kalırsa, onları dibe çökmeye bırakın.
not: Öğütme sırasında köpürtmekten kaçının - köpük oluşursa, durdurun ve aspirasyon ile çıkarın.
- Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 1:10 oranında nörobazal ortamla seyreltin ve Tripan Blue boyası ve bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın. 50 μL seyreltilmiş hücreleri 50 μL Tripan Mavisi çözeltisi ile 0.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde karıştırın. Lameli yerleştirdikten sonra hemasitometreye 10 μL ekleyin ve parlak berrak hücreleri sayın (mavi hücreler ölmüştür ve sayılmamalıdır).
not: Tek bir E7 optik tektumundan elde edilen tipik hücre sayıları 1 ile 5 x 107 hücre/mL arasında değişir.
- Ayrışan hücreleri ECM kaplı MEA'lar üzerine 2.200 hücre/mm kare yoğunlukta plakalayın. MEA sistemimiz için bu, MEA başına yaklaşık 130.000 hücre anlamına gelir. MEA'daki hacmi 1 mL'ye getirmek için nörobazal ortamı ekleyin ve hücre bağlanması ve nörit uzantısı için MEA'ları gece boyunca CO2 inkübatöre yerleştirin (Şekil 1).
not: Farklı alanlara ve elektrot sayılarına sahip MEA'lar için farklı hücre yoğunlukları denenebilir - genel olarak, daha yüksek hücre yoğunluğu daha fazla ağ aktivitesi ile sonuçlanır, ancak aynı zamanda daha kısa ömürlü kültürlere yol açar.
