$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. iPSC'den türetilmiş nöral progenitör hücrelerin (iNPC'ler) üretilmesi
- Aşağıda açıklandığı gibi ve daha önce yayınlandığı gibi iPSC kolonilerinden EZ küreleri üretin.
- mTESR1 veya diğer ticari ortamlarda bazal membran matris kaplı 6 oyuklu plakalar (0,5 mg / plaka) üzerinde birleşecek şekilde kültür iPSC kolonileri (bkz. Malzeme Tablosu).
- iPSC ortamını çıkarın ve 2 mL EZ-küre ortamı [ESM; DMEM: F12 7: 3, 100 ng / mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), 100 ng / mL epidermal büyüme faktörü, 5 μg / mL heparin ve% 2 B27 takviyesi ile desteklenmiştir].
- Her bir birleşim yerinin altını steril bir 1000 μL pipet ucunun veya hücre kazıyıcının arkasıyla iyice kazıyın.
- Tüm hücreleri toplayın ve serbest yüzen kürelerin kendiliğinden oluşumuna izin vermek için ultra düşük bağlantılı bir T25 şişesine yerleştirin. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- Ortamın yarısını taze ESM ile değiştirerek ortam sarardığında küreleri her 2-3 günde bir besleyin. Bu, kürelerin büyümeleri ve bakımları için son derece önemli olan şartlandırılmış ortamda kalmasına izin verir.
- Şişeyi bir tüp rafına yaslayın ve kürelerin yerçekimi ile şişenin köşesine kadar 1-2 dakika çökmesine izin verin.
- Yerleştikten sonra, süpernatantın yarısını 5 mL veya 10 mL serolojik pipetle aspire edin ve taze, önceden ısıtılmış ESM ile değiştirin.
- Daha önce açıklandığı gibi küreleri 200 μm çaplara kadar doğrayarak EZ kürelerini haftalık olarak geçin. EZ küreleri 25 geçişe kadar muhafaza edilebilir ve 8-25 geçişler arasında kullanıldığında idealdir.
- iNPC'lerin tek hücreli süspansiyonunu hazırlayın:
- Nöral farklılaşmayı indüklemek için, EZ küresini tek hücrelere ayırın.
- Doğramadan 3-4 gün sonra bir T75 şişesinden küreleri toplayın ve bunları 15 mL'lik bir koniye aktarın, ardından 2 dakika veya tüm küreler dibe oturana kadar bekletin.
- Yerleşmiş küreleri bozmadan ESM'yi 5 mL'lik bir pipetle yavaşça çıkarın. 1 mL ayrışma çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Çöken kürelerin tedavi edildiğinden emin olmak için 5 dakikalık inkübasyondan sonra ayrışma çözeltisini ve küreleri döndürün.
- Ayrışma çözeltisini yavaşça çıkarın. 1 mL nöral farklılaşma ortamı ekleyin [NDM; DMEM: %2 B27 eksi A vitamini, %1 N2 takviyesi ve insan beyni kaynaklı nörotrofik faktör (hBDNF, 20 ng/mL) içeren F12].
- Tüm küreler ayrışana kadar 1 mL'lik bir pipet ve ardından 200 μL'lik bir pipet kullanarak pipetleme yaparak küreleri tek hücrelere öğütün. Öğütme prosedürü sırasında kabarcık oluşumundan kaçının.
- Bir hemositometre kullanarak ayrışmış hücreleri sayın ve hücreleri 1 x 106 hücre / mL'lik bir nihai yoğunluğa seyreltin. Uygulamaya bağlı olarak yoğunluğu değiştirmek mümkündür.
not: 3 güne kadar kısa süreli kültürler için daha yüksek yoğunluklar (6 x 106 hücre / mL'ye kadar) önerilir ve 3 haftaya kadar uzun süreli uygulamalar için daha düşük yoğunluklar önerilir.
not: Hücreler artık "beyin tarafını" oluşturmak için çipin üst kanalına tohumlanmaya hazırdır.
2. iPSC'lerin iBMEC'lere farklılaşması
- iPSC'leri 1:6 oranında 6 oyuklu bir plakanın tek bir birleşen kuyusundan 6 oyuklu bazal membran matrisi kaplı bir plakaya geçirin. Hücrelerin 24 saat yapışmasına izin verin. iPSC ortamını günlük olarak değiştirin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri günlük olarak sayın.
- Hücreler 1.5-3.0 x 105 hücre / kuyu yoğunluğuna ulaştığında, iPSC ortamını bFGF içermeyen 3 mL koşulsuz ortamla değiştirin [DMEM: F12 1: 1,% 10 nakavt serum replasmanı (KOSR),% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),% 0.5 glutamin takviyesi (Malzeme Tablosu) ve% 100 μM β-merkaptoetanol]. Ortamı 6 gün boyunca her gün değiştirin.
- 6. günde, ortamı endotel hücreli (EC) ortamla değiştirin [% 1 trombositten fakir plazma türevi sığır serumu, 20 ng / mL bFGF ve 10 μM all-trans retinoik asit (RA) ile desteklenmiş insan endotel serumu serbest ortamı (hESFM)]. Ortayı 2 gün bekletin.
- EC ortamını çıkarın ve oyuk başına 1 mL ayrışma çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 35 dk.
inkübe edin
not: Bu, burada kullanılan ayrışma solüsyonunda uzun bir kuluçka süresi olarak kabul edilirken, iBMEC'ler bu tedaviye %90'dan daha yüksek hücre canlılığı ile dayanabilir.
- Hücre süspansiyonunu nazikçe pipetleyerek ve tüm hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpte toplayarak hücreleri kuyudan ayırın.
not: Sert pipetlemeden kaçının. Hücreler kolayca ayrılmazsa, 5 dakika daha inkübe edin.
- Accutase'ı inaktive etmek için 15 mL koniğe 1 hacim EC ortamı ekleyin, 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, ortamı çıkarın ve 1 mL EC ortamı (bFGF ve RA olmadan) ile değiştirin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve hücre yoğunluğunu 14–20 x 106 hücre/mL.
olarak ayarlayın
not: Hücreler artık "kan tarafını" oluşturmak için çipin alt kanalına tohumlanmaya hazırdır.
3. Organ çipinin mikrofabrikasyonu
- BBB çip modeli ve üretimi için daha önce yapıldığı gibi bir organ çipi kullanın. Uzun kanal organ çipi (Malzeme Tablosuna bakınız), esnek gözenekli bir zarla ayrılmış iki üst üste binmiş ve paralel mikro ölçekli kanal içeren oldukça esnek bir polidimetilsiloksan (PDMS) elastomerinden üretilmiştir. Üst ve alt mikro kanal boyutları sırasıyla 1 mm x 1 mm ve 1,0 mm x 0,2 mm'dir. İki kanal, 40 μm aralıklı 7 μm çapında gözenekler içeren, 50 μm kalınlığında PDMS yapımı esnek gözenekli bir zar ile ayrılır. Kanalları ayıran gözenekli zarın yüzey alanı 0,171cm2'dir.
4. Çip hazırlama
- Organ çipleri, çip taşıyıcısı içinde önceden paketlenmiş olarak tedarik edilir ve taşıma sırasında çip hizalamasını bozma veya bozma ihtiyacını ortadan kaldırır. Ek olarak, talaş taşıyıcı, kültür modülü ile çip arasında arayüz görevi gören taşınabilir bir modüle ("Pod") güvenli bir şekilde bağlanır.
- Cipslerin ambalajına %70 etanol püskürtün ve biyogüvenlik kabinine (BSC) getirin.
- Ambalajı açın ve organ çipini steril bir Petri kabına koyun. Talaş ile doğrudan teması önlemek için talaş taşıyıcıyı yalnızca yanlarından tutun.
- Taşıyıcının tırnağının sağa baktığından emin olun (Şekil 1) ve birden fazla çip kullanırken hepsini aynı yönde hizalayın.
- Taşıyıcı sekmesindeki her bir çipi etiketleyin (tam talaş hazırlığı ve iş akışı Şekil 2'de gösterilmiştir).
5. Yüzey aktivasyonu ve ECM kaplama
- Yüzey aktivasyon çözeltisinin hazırlanması
- 5 mg içeren bir şişede sağlanan öykünme reaktifi 1 (ER-1) ışığa duyarlıdır. Kullanmadan hemen önce taze ER-1 solüsyonu hazırlayın. ER-1 bütünlüğü, çiplerin başarılı bir şekilde hazırlanmasında çok önemlidir.
- ER-1.
ile çalışırken BSC'deki ışığı kapatın
not: ER-1 gözü tahriş eder ve BSC'de uygun eldiven ve göz koruması ile kullanılmalıdır.
- Kullanmadan önce ER-1 ve ER-2 reaktiflerinin oda sıcaklığına (RT) dengelenmesini bekleyin.
- Boş, steril 15 mL'lik konik bir tüpü folyo ile sararak çözeltiyi ışıktan koruyun.
- BSC'de, tozu alta yerleştirmek için ER-1 şişesine kısaca dokunun.
- Şişeye 1 mL ER-2 tamponu ekleyin ve içeriğini hemen 15 mL sarılı konik tüpün dibine aktarın. Karıştırmak için pipet yapmayın. Konik tüpe aktarılan çözeltinin rengi kırmızı olacaktır.
- Adım 5.1.6 3x'i tekrarlayın. Son turda, ER-1 şişesini kapatın ve kapaktan kalan tozu toplamak için ters çevirin, ardından çözeltiyi konik tüpe aktarın; bu, toplam hacmi 4 mL ER-1 çözeltisine getirecektir.
- 15 mL konik tüpteki 4 mL ER-1 çözeltisine 6 mL ER-2 çözeltisini, 0.5 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. ER-1, ER-2 çözeltisi içinde tamamen çözülmelidir.
- Yüzey aktivasyonu
- Bir P200 pipeti ve steril 200 μL filtreli pipet ucu kullanarak 200 μL ER-1 karışımı alın.
- Pipeti alt girişe yerleştirin ve karışım alt kanal çıkışından akmaya başlayana kadar 20 μL ER-1 karışımını alt kanaldan itin.
- Yaklaşık 50 μL ER-1 karışımı ekleyin ve üst kanal girişine yerleştirin. Karışımı, üst kanal çıkışından dışarı akmaya başlayana kadar üst kanaldan itin.
- Fazla ER-1 karışımını talaşın yüzeyinden nazikçe aspire ederek çıkarın. ER-1 karışımının kanallardan değil, yalnızca talaş yüzeyinden çıkarıldığından emin olun.
- Ultraviyole (UV) aktivasyonundan önce kanallarda hava kabarcığı olmadığını doğrulayın. Hava kabarcıkları tespit edilirse, kanalı ER-1 karışımı ile yıkayarak kabarcıkları çıkarın.
- Cipsleri içeren açık tabağı UV ışık kutusuna yerleştirin (Emulate Inc. tarafından sağlanır).
- UV ışık kutusunun arkasındaki anahtarı "Tutarlı" ayarına getirin. Gücü açın ve UV aktivasyonunu başlatın. Cipsleri UV ışığı altında 20 dk.
not: Personelin UV ışığına maruz kalmasından kaçının.
- ER-1 karışımını her iki kanaldan da çıkarın.
- Her kanalı 200 μL ER-2 solüsyonu ile yıkayın.
- ER-2'yi her iki kanaldan da çıkarın.
- Her kanalı 200 μL steril soğuk Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile yıkayın.
- Bir sonraki adıma geçene kadar soğuk DPBS'yi kanalların içinde bırakın.
- Hücre dışı matriks (ECM) hazırlama ve kaplama
- Tek tek ECM bileşenlerini soğuk DPBS, su veya başka bir çözücü ile nihai çalışma konsantrasyonlarına kadar birleştirerek ECM çözeltisini hazırlayın. ECM çözeltisi her kullanıldığında taze olarak hazırlanmalıdır.
- Çipin hem üst hem de alt kanallarını, ekilecek hücre tipine göre belirlenen bileşimle ECM ile kaplayın. ECM karışımı kullanıma kadar buz üzerinde muhafaza edilmelidir.
- "Beyin tarafını" kaplamak için laminin (50 μg/mL) kullanın ve bölüm 5.6'da açıklandığı gibi "kan tarafını" kaplamak için 4: 1 oranında (320: 80 μg / mL) karıştırılmış kollajen IV ve fibronektin kullanın.
- ECM alikotlarının hazırlanması
- Soğuk DPBS'de 1 mg / mL laminini 50 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
- Kollajen IV'ü %0.1 asetik asit içinde 1 mg / mL'lik bir konsantrasyona çözün. Çözeltiyi gece boyunca 2-8 ° C'de veya RT'de 1-3 saat veya tamamen eriyene kadar inkübe edin.
- 1 mL kollajen IV: fibronektin (320 μL kollajen IV, 80 μL fibronektin, 600 μL steril çift damıtılmış H2O) karışımı hazırlayın. Karışım -20 °C'de saklanabilir.
- Talaşların ECM ile kaplanması
- Soğuk DPBS'yi her iki kanaldan da tamamen aspire edin. 100 μL kollajen IV: fibronektin çözeltisi almak için bir P200 pipeti ayarlayın.
- Çıkışta küçük bir damlacık oluşana kadar çözeltiyi alt kanal girişinden geçirin. Pipet ucunu çıkardıktan sonra girişte küçük bir damlacık bırakın.
- Laminin solüsyonunu, çıkışta küçük bir damlacık oluşana kadar üst kanal girişinden geçirin. Pipet ucunu çıkardıktan sonra girişte küçük bir damlacık bırakın.
- Kabarcık olmadığından emin olmak için kanallara yakından bakın. Kabarcıklar varsa, tüm kabarcıklar giderilene kadar kanalı uygun ECM solüsyonu ile yıkayın.
- Her çip için 5.5.1–5.5.4 adımlarını tekrarlayın.
- 15 mL'lik konik bir tüpün kapağına 1,5 mL DPBS ekleyin. Ekstra nem sağlamak için DPBS kapağını cipslerle birlikte 150 mm'lik kültür kabına yerleştirin ve kabı parafilm ile kapatın. En iyi sonucu elde etmek için, cipsleri gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
not: İstenirse, hücreler çip aktivasyonu ve ECM kaplaması ile aynı gün tohumlanabilir, ancak gece boyunca inkübasyon tercih edilir. Cipsler, ECM eklendikten ve cipsler 37 °C'de inkübe edildikten 4 saat sonra tohumlanmaya hazır hale gelebilir.
>6. "Beyin tarafı" kanalının tohumlanması ve EZ kürelerinin karışık nöral kültürlere farklılaştırılması
- Hazırlanan cipsleri içeren tabağı BSC'ye getirin. Her iki kanalı da 200 μL NDM ile nazikçe yıkayın.
- Bağlantı noktalarıyla temastan kaçınarak, çipin yüzeyinden fazla ortam damlacıklarını dikkatlice aspire edin. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için her bir çipi tohumlamadan önce hücre süspansiyonunu nazikçe çalkalayın
- "Beyin tarafını" oluşturmak için iNPC'leri üst kanala tohumlamak
- Hücreleri (1 x 106 hücre / mL) çipin üst kanalına tohumlayın. Üst kanal girişine 30-100 μL hücre süspansiyonu içeren bir P200 ucu ekleyin ve ucu pipetten yavaşça serbest bırakın. Boş bir P200 pipeti alın, pistona bastırın, üst kanal çıkışına yerleştirin ve tek hücreli süspansiyonu dikkatlice çipten çekin.
- Çanağın üzerini örtün ve tohumlama yoğunluğunu ve üst kanal içindeki hücrelerin homojen dağılımını kontrol etmek için mikroskoba aktarın. Pipet ucunu çip giriş ve çıkış bağlantı noktalarından yavaşça çıkarın.
- Tohumlama yoğunluğu %20 kapsama alanı olarak görünmelidir. Tohumlama yoğunluğu beklenenden daha yüksek veya daha düşükse veya düzensizse, talaşları BSC'ye geri koyun, kanalı 2x 200 μL taze ortamla yıkayın ve adım 6.3.1'i tekrarlayın.
- Doğru hücre yoğunluğunu onayladıktan sonra, her bir cips partisini tohumladıktan sonra cipsleri hemen 37 °C'de 2 saat inkübatöre yerleştirin. Taze NDM ile bağlanmayan hücreleri yıkayın.
- Akışı başlatmadan önce hücreleri en az 37 saat boyunca günlük NDM değişimi ile 48 °C'de statik koşullar altında tutun. iBMEC'ler, iNPC'ler bağlandıktan sonra veya iNPC tohumlamasını takip eden bir sonraki gün tohumlanabilir.
>7. "Kan tarafını" oluşturmak için iBMEC'leri alt kanala tohumlamak
- Hazırlanan cipsleri içeren tabağı BSC'ye getirin. Alt kanalı 200 μL EC ortamı ile nazikçe yıkayın.
- Bağlantı noktalarıyla temastan kaçınarak, çipin yüzeyinden fazla EC ortamı damlacıklarını dikkatlice aspire edin ve her iki kanalda da ortam bıraktığınızdan emin olun. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için her bir çipi tohumlamadan önce hücre süspansiyonunu nazikçe çalkalayın.
- Bir P200 pipeti kullanarak, 30-100 μL iBMEC hücre süspansiyonu (14-20 x 106 hücre / mL) çekin ve ucu alt kanal girişine yerleştirin. Hücre içeren ucu giriş portunda bırakarak ucu pipetten yavaşça ayırın.
- Pistonu boş uçlu bir P200 pipetine bastırın, alt kanal çıkışına yerleştirin ve pipet pistonunu yavaşça serbest bırakarak tek hücreli süspansiyonu alt kanaldan dikkatlice çekin.
- Çipin yüzeyinden fazla hücre süspansiyonunu aspire edin. Kanallardan hücre süspansiyonunun aspire edilmediğinden emin olmak için giriş ve çıkış portlarıyla doğrudan temastan kaçının.
- Çipin üzerini örtün ve tohumlama yoğunluğunu gözlemlemek için mikroskoba aktarın. Alt kanal, mikroskop altında 4x veya 10x'te gözlemlendiğinde hücreler arasında gözlemlenebilir boşluklar olmayacak şekilde doldurulmalıdır (Şekil 3).
- Tohumlama yoğunluğu %90'ın altındaysa veya eşit olmayan bir şekilde dağılmışsa, hücre yoğunluğunu buna göre ayarlayın ve kanal içinde doğru yoğunluk elde edilene kadar 7.2-7.6 arasındaki adımları tekrarlayın. Doğru hücre yoğunluğunu onayladıktan sonra (Şekil 3), kalan çiplerdeki hücreleri tohumlayın. Hücreleri alt kanalın üst kısmında bulunan gözenekli zara bağlamak için, her bir çipi ters çevirin ve bir çip kızağında dinlendirin.
- Hücrelere nem sağlamak için 150 mm'lik çanağın içine küçük bir hazne (steril DPBS içeren 15 mL konik tüp kapağı) yerleştirin. Talaşları 37 °C'de yaklaşık 3 saat veya alt kanaldaki hücreler bağlanana kadar inkübe edin. iBMEC'ler takıldıktan sonra (tohumlamadan ~ 3 saat sonra), alt kanalın alt kısmına hücre bağlanmasına izin vermek için çipleri tekrar dik konuma çevirin.
8. Akışın başlatılması
- Akış tipik olarak iBMEC'lerin tohumlanmasından 48 saat sonra başlatılır. Bu süre, iBMEC'lerin çipe sıkıca bağlanması için gereklidir.
- Çip boyunca laminer akışı korumak için, ortamın sıcaklığının gazdan arındırılması ve dengelenmesi önemlidir. Ortam, 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 saat önceden ısıtılmalıdır.
- 50 mL'ye kadar ısıtılmış ortam, vakumla çalışan bir filtreleme sistemi altında 15 dakika boyunca inkübasyon yoluyla gazdan arındırılabilir.
- Portatif modüllerin astarlanması
- Taşınabilir modül ambalajının ve tepsilerinin dışını %70 etanol ile sterilize edin, silin ve BSC'ye aktarın. Paketi açın ve modülleri tepsiye yerleştirin. Bunları rezervuarlarla birlikte tepsinin arkasına doğru yönlendirin.
- Her bir giriş haznesine 3 mL önceden dengelenmiş, ılık ortam pipetleyin. Alt kanalın giriş rezervuarına EC kültür ortamını ve üst kanalın üst kanal giriş rezervuarına NDM ekleyin (Şekil 4).
- 300 μL önceden dengelenmiş, sıcak ortamı her bir çıkış haznesine, doğrudan her bir çıkış portunun üzerine pipetleyin (Şekil 4).
- Her tepsiye altı adede kadar taşınabilir modül yerleştirin. Tepsileri inkübatöre getirin ve tepsi sapı dışa bakacak şekilde tamamen kültür modülüne kaydırın.
- Kültür modülünde "Prime" döngüsünü seçin ve çalıştırın. İnkübatör kapısını kapatın ve kültür modülünün taşınabilir modülleri doldurmasına izin verin (~1 dakika sürer). Durum çubuğunda "Hazır" yazdığında hazırlama döngüsü tamamlanır. Tepsiyi kültür modülünden çıkarın ve BSC'ye getirin.
- BSC'deki her bir taşınabilir modülün alt tarafını inceleyerek taşınabilir modüllerin başarıyla hazırlandığını doğrulayın. Dört bağlantı noktasının hepsinde küçük damlacıkların varlığına bakın.
- Herhangi bir taşınabilir modül damlacık göstermiyorsa, bu modüllerde ana döngüyü yeniden çalıştırın. Tepsiye herhangi bir ortam damlarsa (bu, çıkış bağlantı noktalarında daha sık meydana gelebilir), tepsiyi %70 etanol ile temizleyin.
- Çiplerin taşınabilir modüllere bağlanması, akışın düzenlenmesi ve başlatılması
- Kanaldaki olası kabarcıkları gidermek için her bir çipin her iki kanalını da ılık, dengelenmiş hücreye özgü kültür ortamıyla nazikçe yıkayın ve her bir giriş ve çıkış portunun üstüne küçük medya damlacıkları (kanaldaki ortama göre) yerleştirin.
- Taşıyıcılı çipleri taşınabilir modüllere yerleştirin ve her tepsiye altı adede kadar yerleştirin. Tepsileri kültür modülüne yerleştirin. Uygun organ çip kültürü koşullarını (akış hızı ve esneme) kültür modülü üzerinde programlayın.
- Programlanan koşullar, "Düzenleme" döngüsü tamamlanır tamamlanmaz başlayacaktır.
not: Her kanal için akış hızları bağımsız olarak kontrol edilebilir ve 0–1.000 μL/s arasında değişen hızlara ayarlanabilir. BBB çipi tipik olarak 30 μL/s'de kültürlenir. EC ortamı veya ESM gibi ortamları 30 μL/sa ve 1000 μL/s'de akarken, kesme kuvvetleri sırasıyla 0,01 dyn/cm2 ve 0,33 dyn/cm2'dir.
- Yaklaşık 2 saat süren "Düzenleme" döngüsünü çalıştırın, ardından kültür modülü önceden ayarlanmış organ çipi kültür koşullarında akışa başlayacaktır.
