$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Dorsolateral Telencephalon Mikrodiseksiyonu
- Diseksiyon ortamını hazırlayın (100 mL): 98.5 mL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 0.5 mL 5 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) pH 7.4, 1 mL penisilin / streptomisin (10.000 birim / mL ve 10.000 μg / mL).
- Diseksiyon ortamını filtreyle sterilize edin.
- İzofluran ile anestezi altında hamile bir fare C57 / Bl6'dan (Mus musculus) embriyonik gün 14 (E14) embriyolarını çıkarın.
not: E0'ı vajinal tıkaç tespit günü olarak düşünün. Diseksiyon, hamile fareden çıkarıldıktan sonra en geç 1 saat içinde tamamlanmalıdır. Bu protokol aynı zamanda E11-E17 embriyoları için de geçerlidir.
- Steril koşullar altında histerektomi ile embriyoları çıkarın.
- Embriyoları soğuk diseksiyon ortamı (4 °C) olan bir Petri kabına aktarın.
- Uzunlamasına çatlak boyunca keserek beyinleri kafatasından çıkarın. Embriyo sayısı genellikle beş ila on arasında değişir. Her E14 beyni, progenitörler ve postmitotik nöronlar (1: 1 oranı) dahil olmak üzere yaklaşık 2 x 106 hücre verir
not: Aşağıdaki adımlar için stereomikroskobu kullanın.
- Diseksiyon forsepsleri kullanarak meninksleri çıkarın. Yarım küreleri ayırmak için telensefalonu ortadan bölün. Dorsolateral telensefalonu izole etmek için, diseksiyon forsepsleri kullanarak dorsomedial eğri ve pallial-subpallial sınır boyunca kesin. Dorsolateral telensefalonu, tüm beyinler diseke edilene kadar soğuk diseksiyon ortamı (4 ° C) ile 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
2. Hücre Ayrışması ve Kaplaması
- Proliferasyon ortamını hazırlayın (50 mL DMEM +% 10 FCS): 44 mL Dulbecco Modifiye Eagle's Medium (DMEM), 5 mL Fetal Buzağı Serumu (FCS), 0.5 mL% 40 glikoz, 0.5 mL penisilin / streptomisin (10.000 ünite / mL ve 10.000 μg / mL). Proliferasyon ortamını filtreyle sterilize edin.
- Farklılaşma ortamı hazırlayın (50 mL DMEM +% 2 B27): 48 mL DMEM, 1 mL B27, 0.5 mL% 40 glikoz, 0.5 mL penisilin / streptomisin (10.000 birim / mL ve 10.000 μg / mL). Farklılaştırma ortamını filtreyle sterilize edin.
- Dorsolateral telensefalonun E14 farelerinden alınan mikro diseksiyonundan sonra, dokuyu çökeltmek için tüpü toplanan doku ve soğuk diseksiyon ortamı (4 ° C'de 5 dakika, 340 x g) ile santrifüjleyin.
- Süpernatanı bir pipetle çıkarın ve kimyasal sindirim için 1 mL önceden ısıtılmış (37 °C) Tripsin-Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (%0,05) ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Tripsin aktivitesini durdurmak için 2 mL proliferasyon ortamı ekleyin.
- Diyaframı biraz daraltmak için bir cam Pasteur pipetinin ucunu bir gaz brülörü veya Bunsen brülörü üzerinde birkaç saniye parlatın. Pipeti, ucu kaplamak için FCS'yi aspire ederek yıkayın. Kabarcıkları önlemek için, hücreleri ateşle parlatılmış ve FCS kaplı bir Pasteur pipeti ile mekanik olarak ayırın.
- Hücreleri santrifüjleyin (4 ° C'de 5 dakika, 340 x g). Süpernatanı bir pipetle çıkarın. 1 mL proliferasyon ortamı ekleyin ve bir pipet kullanarak hücreleri yeniden süspanse edin. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
- % 0.4 Tripan Mavisi çözeltisi kullanarak hücre süspansiyonunun 1: 1 oranında seyreltilmesini hazırlayın. Canlı olmayan hücreler mavi olacaktır. Bir Neubauer odası kullanarak, canlı hücrelerin sayısını sayın (boyanmamış).
- 106 hücre / mL elde etmek için hücreleri bir proliferasyon ortamında seyreltin. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna (yaklaşık 2.5 × 105 hücre /cm2) 500 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri 37 ° C ve% 5 CO2.
'de inkübe edin
not: Deney sırasında hareket edebilecekleri ve gözlem alanını değiştirebilecekleri için cam lameller kullanmayın. Alternatif olarak, cam alt doku kültürü plakaları kullanın.
not: Hücre kültürü ile muamele edilmiş çoklu yemekler kullanmıyorsanız, tabaklarınızı 37 °C'de 2 saat boyunca Poly-D-Lysin (50 μg/ml) ile ön işleme tabi tutmanız önemlidir. PDL ile muamele edilmiş plakalar, damıtılmış su ile yıkandıktan sonra 4 °C'de saklanabilir.