$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>NOT: Hücre kültürü çözeltileri, biyolojik bir güvenlik kabininde steril prosedürler kullanılarak hazırlanmalı ve kontaminasyonu önlemek için 0,2 μm'de filtrelenmelidir.
1. Çözeltilerin ve kültür ortamının hazırlanması
- 20 μL 1 mg / mL laminin stoğunu 2 mL steril damıtılmış H2O içine seyrelterek laminin kaplama çözeltisi hazırlayın. Diseksiyon gününde hazırlayın.
- 45 mL 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS) 5 mL ES ekleyerek% 10 at (at) serumu (ES) durdurma çözeltisi hazırlayın. 0,2 μm filtre sistemi veya şırınga filtre ucu kullanan steril filtre. 4 °C'de saklayın.
- 1x fosfat tamponlu saline (PBS) 2 g BSA tozu ekleyerek ve 45 mL'lik bir nihai hacme getirerek% 4 sığır serum albümini (BSA) stok çözeltisi hazırlayın. 0,2 μm filtre sistemi veya şırınga filtre ucu kullanan steril filtre. 4 °C'de saklayın.
- Papain'i 1x HBSS'de 3 mg / mL'ye seyrelterek papain stok çözeltisini hazırlayın. 0,2 μm filtre sistemi veya şırınga filtre ucu kullanan steril filtre. -20 °C'de saklayın.
- SterilH2O'ya20 mg DNaz tozu ekleyerek ve 20 mL'lik bir nihai hacme getirerek deoksiribonükleaz (DNaz) çözeltisi hazırlayın. 0,2 μm filtre sistemi veya şırınga filtre ucu kullanan steril filtre. -20 °C'de saklayın.
- Steril damıtılmış H2O'ya 352 mg askorbik asit ekleyerek ve 20 mL'lik bir nihai hacme getirerek bir askorbik asit stok çözeltisi hazırlayın. Gerekirse, çözünmesi için 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın. 0,2 μm filtre sistemi veya şırınga filtre ucu kullanan steril filtre. -20 °C'de saklayın.
- 50 mL Nörobazal ortama aşağıdakileri ekleyerek Hücre Kültürü Ortamını hazırlayın: 500 μL Glutamax (100x), 500 μL at serumu, 1 mL B-27, 100 μL askorbik asit, 500 μL penisilin-streptomisin, 50 μL kanamisin ve 50 μL ampisilin. 0,2 μm filtre sistemi kullanan steril filtre. 4 °C'de saklayın.
- % 10'luk bir çözelti elde etmek için 9 mL 1x PBS'ye 1 mL Triton X-100 ekleyerek % 0.01 Triton X-100 Çözeltisi hazırlayın. Triton X-100 viskoz olduğundan, ucun tamamen dolmasını sağlamak için yavaşça pipetleyin. Gerekirse çözünmesi için 37 °C'lik bir banyoda ısıtın. 4 °C'de saklayın.
- %10 Triton X-100 stoğunu %0.01'e seyreltmek için 3 seri 1:10 seyreltme gerçekleştirin. % 1 çözelti yapmak için 1 mL %10 stoğu 9 mL 1x PBS'ye seyreltin. % 0.1 çözelti elde etmek için 1 mL% 1'lik çözeltiyi 9 mL 1x PBS'ye seyreltin. % 0.01'lik bir çözelti elde etmek için 1 mL %0.1'lik çözeltiyi 9 mL 1x PBS'ye seyreltin.
- % 10'luk bir çözelti için 9 mL 1x PBS'ye 1 mL NGS ve% 1'lik bir çözelti için 9 mL NGS'ye 100 μL NGS ilave% 1'lik bir çözelti yapmak için 1 μL NGS'ye 1 μL NGS ekleyerek% 1 ve 1% normal keçi serumu (NGS) çözeltileri hazırlayın.
- Steril damıtılmış H2O'ya 735 mg L (+) - glutamik asit ekleyerek ve 50 mL'lik nihai hacme getirerek bir glutamat stok çözeltisi (100 mM) hazırlayın. Bu konsantrasyonda çözünürlük bir sorun olacaktır. Çözünürlüğü artırmak için küçük hacimlerde (100 μL) 1 M hidroklorik asit eklemek yeterlidir.
- Steril damıtılmışH2O'ya50 mg NBQX ekleyerek ve 13 mL'lik nihai hacme getirerek NBQX stok çözeltisini (10 mM) hazırlayın.
2. Kültür kaplarının ve lamellerin hazırlanması (Diseksiyondan bir gün önce yapılır)
>NOT: Poli-L-lizin, poli-L-ornitin ve laminin olmak üzere üç kaplama maddesinin birleştirilmesinin ideal hücre yapışması ve canlılığına izin verdiğini bulduk.
- 10 adet 35 mm'lik Petri kabını biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin. Her tabağa iki adet dairesel 12 mm'lik lamel yerleştirin ve 10 dakika boyunca %70 EtOH ile doldurun. Her tabaktan kalan EtOH'yi aspire etmek için bir vakum hattı kullanın ve EtOH'nin tamamen buharlaşmasına izin verin.
- Her lamel üzerine ~ 90-100 μL %0.1 poli-L-lizin solüsyonu pipetleyin ve tüm lamellerin kaplandığından emin olun. Bulaşıkları kapaklarla kapatın ve 37 °C'lik bir inkübatörde 1 saat bekletin.
- Kalan poli-L-lizin çözeltisini her bir lamel den aspire edin ve steril H2O ile durulayın.
- % 0.1 poli-L-ornitin çözeltisi ile 2.2 - 2.3 adımlarını tekrarlayın.
- Yine,% 0.01 laminin çözeltisi ile 2.2 - 2.3 adımlarını tekrarlayın. Ertesi gün hücre kaplaması için hazır olana kadar 37 °C/%5 CO2 inkübatöre koyun.
3. Fare embriyonik diseksiyonları
>NOT: Kültür başına 4 ila 6 zamanlı gebe fare kullanıyoruz. Diseksiyon işleminin çoğu biyolojik güvenlik kabininin dışında gerçekleşse de, steril bir prosedürün sürdürülmesi hala önemlidir. Diseksiyon mikroskobunun yakınındaki yüzeylerde ve cerrahi aletlerde %70 EtOH'nin bol miktarda kullanılması idealdir. Kontaminasyonu daha da önlemek için diseksiyon sırasında bir maske de takılabilir. Ek olarak, kültür ortamında 4 ayrı antibiyotik kullanıyoruz, bu nedenle kontaminasyon olasılığı düşüktür. Bununla birlikte, antibiyotik kullanımı sorunluysa, bu diseksiyon kurulumu steril bir başlık içine taşınabilir. Hücre canlılığını korumak için tüm diseksiyon solüsyonları 4 °C'de önceden soğutulmalı ve diseksiyonlar mümkün olduğunca çabuk tamamlanmalıdır. Diseksiyonları buz üzerinde yapmıyoruz. Fare embriyonik orta beyin nöronlarının diseksiyonu için yöntem, daha önce açıklanan yöntemlerle aynıdır.
- Emici bir ped ile diseksiyon mikroskobunun yanındaki bir tezgahta bir boşluk hazırlayın ve% 70 EtOH ile bolca püskürtün.
- İki adet 100 x 15 mm cam Petri kabı ve bir adet 50 x 10 mm cam Petri kabına %70 EtOH püskürtün ve EtOH'nin buharlaşmasına izin verin. Buharlaştıktan sonra, her 100 x 15 mm'lik Petri kabına 50 mL steril 1x HBSS yerleştirin.
- Cerrahi makası, forsepsleri ve mikrotom bıçağını sterilize etmek için en az 10 dakika boyunca %70 EtOH'ye batırın. Aletleri kuruması için emici pedin üzerine yerleştirin.
- CO2 ve ardından servikal çıkık kullanarak, embriyonik 14. günde 2-3 aylık zamanlanmış gebelik farelerine ötenazi yapın.
- Ötenazi uygulanmış farelerin karınına% 70 EtOH püskürtün. Forseps kullanarak alt karın bölgesini tutun ve cerrahi makas kullanarak karın boşluğunu açın. Forsepslerin karnı tuttuğu yerin yakınında kesmeye başlayın, karın duvarı geriye katlanana ve uterus açıkça görünene kadar her iki tarafta yanal kesikler yapın.
- Cerrahi makas kullanarak rahim boynuzunun her iki ucunu da kesin. Daha sonra uterusu çıkarın ve 1x HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
- Düz uçlu forseps kullanarak embriyoları uterustan dikkatlice çıkarın. Bu süreç boyunca embriyoları HBSS'de bırakın. Forseps veya bir mikrotom bıçağı kullanarak, boynun yakınında keserek embriyoları hızlı bir şekilde ayırın. Mümkün olduğunca düz bir kesim yapmak.
- Diseksiyon mikroskobu altında, bir embriyo kafasını 50 mm'lik kuru bir Petri kabına taşıyın ve ventral tarafa yerleştirin. Gözlerin/burnun yakınına yerleştirerek ve nüfuz ederek başı forseps ile sabitleyin. Mezensefalonun nüfuz etmesini önlemek için forsepsler ~ 45 ° 'de aşağı doğru açılı olmalıdır.
- Öte yandan forsepsleri kullanarak, mezensefalonun belirgin sırtından hemen önce yarı saydam deri ve kafatası tabakasını dikkatlice çıkarın. Orta hattın yakınından başlayın ve mezensefalon tamamen açığa çıkana kadar cildi ve kafatasını kaudal olarak çıkarın.
- Forsepsleri açıkta kalan mezensefalona dik olarak, bir ucu korteks ile mezensefalon arasında, diğeri ise beyincik yakınında tutun. Tüm orta beyni çıkarmak için forsepsleri bastırın ve sıkıştırın. Orta beyin segmenti yaklaşık 0,5 mm kalınlığında olmalıdır. Orta beyin segmentini taze 1x HBSS ile doldurulmuş ikinci Petri kabına yerleştirin. Her embriyo için bu işlemi tekrarlayın.
- Diseksiyon mikroskobunu kullanarak, beyin segmentini ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Meninksler hala takılıysa, forseps ile tutarak ve beyin segmentinden yukarı ve uzağa kaldırarak dikkatlice çıkarın.
- Beyin segmentinin 4 görünür kadranı olmalıdır. Segmenti, iki küçük kadran iki büyük kadrandan daha üstün konumlandırılacak şekilde yerleştirin. Üstteki iki (küçük) kadranı alttaki iki (büyük) kadrandan ayıran belirgin bir çıkıntı vardır.
- Forsepsleri kullanarak, üst kadranları alt kadranlardan sıkıştırın ve ayırın ve ardından üst kadranları atın. Kalan alt kadranlar, dorsal tarafta lateral olarak fazla dokuya sahip olacaktır, bu doku kalan ventral dokudan daha az opak görünecektir. Daha az yoğun sırt dokusunu çıkarın ve atın. Kalan segment hem Substantia nigra pars compacta'yı (SNc) hem de ventral tegmental alanı (VTA) içermelidir.
- Forseps kullanarak, kalan ventral doku segmentini 4 küçük parçaya kesin ve 1 mL genişliğinde delikli bir pipet kullanarak, bu segmentleri 1x HBSS'li 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Beyin segmentleri olan konik tüpü işlem boyunca buz üzerinde tutun.
- Kalan tüm beyin segmentleri için bu işlemi tekrarlayın.
4. Hücrelerin ayrışması
- Hücrelerin enzimatik sindirimi
- HBSS'yi, orta beyin segmentlerini içeren 15 mL'lik konik tüpten dikkatlice aspire edin ve segmentleri tüpün altında bırakın.
- Tüpe ~ 800 μL papain çözeltisi ekleyin ve 7 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Tüpü hafifçe vurarak hücreleri yeniden askıya alın ve 7 dakika daha 37 ° C inkübatörle değiştirin.
- Geniş delikli 1 mL'lik bir pipet ucuyla, yalnızca orta beyin segmentlerini 1 mL'lik bir DNaz alikotuna çıkarın. Segmentlerin alikotun dibine veya yaklaşık 1 dakikalık pozlamaya ulaşmasına izin verin.
- Geniş delikli 1 mL'lik pipet ucuyla, yalnızca orta beyin segmentlerini 2 mL durdurma solüsyonu içeren 15 mL'lik konik bir tüpe çıkarın. Segmentlerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve durulamayı durdurma solüsyonu ile doldurulmuş ek bir konik tüpte tekrarlayın.
- Hücre süspansiyonunun mekanik tritürasyonu
- İkinci durakta, geniş delikli 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak solüsyon durulama tüpü, büyük doku segmentleri görünmeyene kadar hücreleri 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Minimal hücre lizisi için aşırı titürasyondan kaçınmak önemlidir.
- Beyin segmentlerini içeren 15 mL'lik konik tüpün dibine 300 μL% 4 BSA solüsyonunu yavaşça pipetleyin. Bir süspansiyon tabakasını korumak için pipet ucunu dikkatlice çıkarın. 3 dakika boyunca 0,4 x g'da santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri 400 μL hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin.
5. Hücrelerin kaplanması
NOT: Deneyime dayanarak, embriyo başına yaklaşık 100.000 canlı hücre toplanır. 2-3 aylık zamanlanmış hamile fareler tipik olarak 8-10 embriyoluk çöp boyutlarına sahiptir; Bu nedenle, zamanlanmış hamile fare başına toplam hücre verimi için kaba bir tahmin yaklaşık 1 milyon hücredir.
- Bir hemositometre kullanarak, bir hücre sayımı yapın ve ardından bir hücre kültürü ortamı kullanarak süspansiyonu 2.000 hücre / μL'ye seyreltin. Karıştırmak için kısaca ezin.
- Adım 2'deki laminin solüsyonlu lamelleri inkübatörden çıkarın ve kalan laminin solüsyonunu bir vakum kullanarak kaplanmış lamellerden aspire edin. Lamellerin tamamen kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde plakalayın. Her lamel üzerine 100 μL (2,0 x 105 hücre/lamel ) pipetleyin ve Petri kaplarını 1 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Her yemeğe dikkatlice 3 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve tekrar 37 °C inkübatöre yerleştirin. 2 hafta boyunca haftada iki kez yarı-orta değişiklikler yapın.
>6. 14 DIV'de hücre kültürünün adeno-ilişkili viral (AAV) vektörlerle enfeksiyonu
- Her yemek için 1 μL hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 x 1013 titre) ile 1 mL serumsuz DMEM ortamı hazırlayın
- Hücre kültürü ortamını her tabaktan aspire edin ve hSyn-GCaMP6f içeren 1 mL serumsuz DMEM ile değiştirin. Daha sonra bulaşıkları 37 °C'lik inkübatöre 1 saat geri koyun.
- AAV'ler içeren serumsuz ortamı aspire edin ve 3 mL hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Bulaşıkları tekrar 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin. 5-7 günlük AAV enfeksiyonunun ideal GCaMP ekspresyonu seviyelerine izin verdiğini bulduk. Bu viral enfeksiyon dönemi boyunca, ortamı her 2-3 günde bir değiştirmeye devam edin.
7. 19-21 DIV arasında canlı konfokal Ca2+ görüntüleme
- Kayıt tamponlarının hazırlanması
- 1 L HEPES kayıt tamponu yapmak için şunu ekleyin: 9.009 g NaCl, 0.3728 g KCl, 0.901 g D-glikoz, 2.381 g HEPES, 2 mL 1 M CaCl2 stok çözeltisi ve 500 μL 1 M MgCl2 stok çözeltisi 800 mL steril damıtılmış H2O'ya kadar. NaOH ile pH'ı 7.4'e getirin. 1 L'lik son hacme getirin.
- 200 mL 20 μM glutamat kayıt tamponu yapmak için, 40 μL 100 mM glutamat stok çözeltisini yukarıda açıklanan 200 mL HEPES kayıt tamponuna seyreltin.
- 200 mL 10 μM NBQX kayıt tamponu yapmak için, 200 μL 10 mM NBQX stok çözeltisini 200 mL HEPES kayıt tamponuna seyreltin.
- Konfokal görüntüleme
- Steril 35 mm'lik bir Petri kabını 3 mL kayıt tamponu ile doldurun.
- Enfekte kültürler içeren 35 mm'lik bir Petri kabını 37 °C inkübatörden çıkarın. İnce uçlu forseps kullanarak, bir lamel kenarını dikkatlice tutun ve hızlı bir şekilde kayıt tamponu ile doldurulmuş Petri kabına aktarın. Ortamda kalan lamel 37 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin. Çanağı kayıt tamponu ile konfokal mikroskoba taşıyın.
- Görüntüleme yazılımını başlatın. Başlatılırken bir sonraki adıma geçin.
- Peristaltik pompayı çalıştırın ve hattı kayıt arabelleğine yerleştirin. Akış hızını 2 mL/dk olacak şekilde kalibre edin.
- Enfekte lamel 35 mm Petri kabından kayıt banyosuna aktarın.
- 10x suya daldırma objektifini ve BF ışığını kullanarak, odak düzlemini bulun ve yüksek yoğunluklu nöron hücresi gövdelerine sahip bir bölge arayın. 40x suya daldırma hedefine geçin ve BF ışığı kullanarak numuneyi yeniden odaklayın.
- FluoView içindeki "Boyalar listesi" penceresinde AlexaFluor 488'i seçin ve uygulayın.
- AAV ekspresyonu değişken olabilir; bu nedenle, floroforların aşırı maruz kalmasını ve foto-ağartılmasını önlemek için, düşük HV ve lazer gücü ayarlarıyla başlayın. AlexaFluor 488 kanalı için yüksek voltajı (HV) 500'e, kazancı 1x'e ve ofseti 0'a ayarlayın. 488 lazer çizgisi için gücü %5'e ayarlayın. Z düzleminde görüntülenen etkin hacmi artırmak için iğne deliği boyutunu 300 μm'ye yükseltin. Emisyon sinyallerini alt doygunluk seviyelerine en iyi şekilde ayarlamak için "odak x2" tarama seçeneğini kullanın. Buradan, her kanalın ideal görünürlüğü elde edilene kadar ayarlar yapılabilir.
not: GCaMP ile tüm Ca2+ akı aralığını doğru bir şekilde yakalamak için, dedektörü aşırı doygunlaştırmadan floresan yoğunluğunda bir artışa izin vermek için temel HV ve lazer güç ayarlarını yapın.
- Mikroskop ayarları optimize edildikten sonra, GCaMP6f floresansında spontan değişiklikler gösteren birden fazla hücrenin bulunduğu bir bölgeyi bulmak için sahneyi hareket ettirin ve görüntüleme için istenen düzleme odaklanın.
- Görüntüleme çerçevesini 1 saniyenin biraz altında bir kare aralığı elde edebilecek bir boyuta kırpmak için "Klip düzeltme" aracını kullanın. Bu, görüntüleme aralığını saniyede 1 kare olarak ayarlamak için gereklidir.
- "Aralık" penceresini 1.0 değerine ve "Num" penceresini 600 değerine ayarlayın.
not: İstenen zaman noktasında (300 s) farklı kayıt tamponları sağlamak için, yeni çözeltiyi banyoya iletmek üzere pompanın gecikmesini kalibre etmek önemlidir. Bu, çözelti perfüzyon hızına (2 mL / dak) ve çözeltiyi pompalamak için kullanılan hattın uzunluğuna bağlı olacaktır.
- Bir t serisi film çekmek için "Zaman" seçeneğini seçin ve ardından görüntülemeye başlamak için "XYt" tarama seçeneğini kullanın.
- Görüntüleme ilerleme çubuğunu izleyin ve hattı HEPES kayıt tamponundan uygun zaman noktasında 20 μM glutamat kayıt tamponuna taşıyın (örneğin, pompanın gecikmesi 60 s'de çözelti verecek şekilde kalibre edilmişse, 300 s'de glutamat vermek için hattı 240 karede glutamat tamponuna taşıyın).
- Görüntüleme tamamlandığında, Seri Bitti düğmesini seçin ve bitmiş t serisi filmi kaydedin. 20 μM Glutamat'ı 5 dakika daha perfüze etmeye devam edin, böylece kültürlenmiş nöronlar toplam 10 dakika boyunca glutamata maruz kalır. Görüntülenecek her lamel için bu işlemi tekrarlayın.
- 20 μM Glutamata 5 dakika daha maruz kaldıktan sonra, lameli banyodan çıkarın ve görüntüleme günü tamamlanana kadar kayıt tamponu içeren 35 mm'lik Petri kabına geri koyun.