Bir Sıçan Yavrusu Beyninden Rhinal Cortex-Hipokampus Dilimlerinin Hazırlanması

Özet

Kaynak: Valente, C. A., et al., Rhinal Cortex-Hipokampus Organotipik Dilim Kültürlerinde Bir Epileptogenez Modeli. J. Vis. Uzm. (2021)

Video, bir sıçan yavrusunun beyninden rinal korteks-hipokampus dilimleri elde etmek ve bunları daha fazla analiz için ortamla doldurulmuş çok kuyulu bir plaka içinde zarlı ekler halinde kültürlemek için bir yöntemi göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Rinal korteks-hipokampus dilimlerinin hazırlanması

NOT: Rinal korteks-hipokampus dilimlerinin hazırlanmasında P6-7 Sprague-Dawley sıçanları kullanılır.

1. Kültür kurulumu ve besiyeri hazırlama
   1. Kültürden bir gün önce gerekli besiyerini hazırlayın ve 4 °C'ye yerleştirin.
   2. Diseksiyon ortamını hazırlayın: Gey'in Dengeli Tuz Çözeltisinde (GBSS) 25 mM glikoz.
   3. Kültür ortamını hazırlayın:% 50 Opti-MEM,% 25 HBSS,% 25 At Serumu (HS), 25 mM glikoz, 30 μg / mL Gentamisin.
   4. Bakım ortamı hazırlayın: Neurobazal-A (NBA),% 2 B27, 1 mM L-glutamin, 30 μg / mL Gentamisin, HS (% 15,% 10,% 5 ve% 0).
2. Beyin hasadı
   1. Kültüre başlamadan hemen önce, bir P1000 pipeti ile 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1,1 mL kültür ortamı ekleyin ve 37 °C'ye yerleştirin.
   2. Tüm ekipmanı (diseksiyon mikroskobu, doku doğrayıcı, diseksiyon lambası, diseksiyon aletleri, elektrotlar, plakalar, ekler ve filtre kağıtları) biyolojik güvenlik kabininin içine yerleştirin ve UV ışığı altında 15 dakika sterilize edin.
   3. Dilim kalınlığını 350 μm'ye ayarlayın.
   4. GBSS'yi buzdolabından çekin. Altı Petri kabına 5 mL GBSS ekleyin. Hayvan başına altı Petri kabı gerekecektir.
   5. Sıçan yavrusuna ötenazi yapın. Hayvanın beyin sapının tabanında keskin bir makas kullanarak kafa kesme işlemi yapın.
   6. Hayvan kafasını soğuk GBSS'de üç kez yıkayın ve güvenlik kabininin içine alın.
3. Doku izolasyonu ve dilimlerin hazırlanması
   1. Kafayı tutmak için keskin forsepsleri göz yuvalarına sıkıca yerleştirin.
   2. İnce bir makas kullanarak, vertebral foramenden başlayarak frontal loblara doğru orta hat boyunca cildi/kafa derisini kesin ve bir kenara koyun.
   3. Kafatası ile aynı şekilde ve serebral transvers fissür (beyin ve beyincik arasındaki boşluk) boyunca kesin. Kavisli uzun forseps ile ayırın.
   4. Koku ampullerini bir spatula ile atın. Beyni kafadan çıkarın ve sırt yüzeyi yukarı bakacak şekilde buz gibi GBSS'ye yerleştirin (Şekil 1A).
   5. İnce forsepsleri beyinciklere yerleştirin ve spatula ile orta hat boyunca ilerleyin, her yarım küreyi çok dikkatli bir şekilde açın (Şekil 1B).
   6. Kısa eğri forsepslerle, hipokampal yapıya dokunmadan, hipokampusu kaplayan fazla dokuyu dikkatlice çıkarın. Daha sonra bir spatula ile her hipokampusun altını kesin (Şekil 1C).
   7. Bir yarım küre alın ve hipokampus yukarı bakacak şekilde bir filtre kağıdına yerleştirin. Prosedürü diğer yarım küre ile tekrarlayın ve filtre kağıdına birincisine paralel olarak yerleştirin. Filtre kağıdını, yarım küreler bıçağa dik olacak şekilde doku doğrayıcıya koyun ve yarım küreleri 350 μm'lik dilimler halinde kesin (Şekil 1D).
   8. Dilimlenmiş dokuyu soğuk GBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 1E).
   9. Yuvarlak uçlu elektrotları kullanarak dilimleri dikkatlice ayırın (Şekil 1F). Sadece yapısal olarak sağlam bir rinal korteks ve hipokampus ile dilimleri saklayın. DG ve CA alanlarının yanı sıra entorinal ve perirhinal korteks de mükemmel bir şekilde tanımlanmalıdır (Şekil 1G).
   10. Her dilimi bir spatula ve yuvarlak uçlu bir elektrot ile ek parçanın üzerine yerleştirin (Şekil 1H-I). Her dilimin etrafındaki fazla diseksiyon ortamını bir P20 pipeti ile çıkarın (Şekil 1J). Dört rinal korteks-hipokampus dilimi tek bir ekte kültürlenebilir (Şekil 1K).
4. Kültür bakımı
   1. Ortamı iki günde bir değiştirin.
   2. Ortamı 37 °C'de ısıtın.
   3. Plakaları inkübatörden alın. Plastik kenarı forseps ile tutarak her bir parçayı alın (Şekil 1L).
   4. Ortamı kuyudan aspire etmek için serbest bir el kullanın. Ek parçayı tekrar kuyuya yerleştirin ve bir P1 pipet ile 1000 mL taze ısıtılmış ortam ekleyin (Şekil 1M). Tüm ekler için tekrarlayın. Membran ile ortam arasında hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun.

Sonuçlar

Şekil 1: Rinal korteks-hipokampus organotipik dilimlerinin hazırlanması için ayrıntılı prosedür. (A) Beyni kafadan çıkarın ve sırt yüzeyi yukarı bakacak şekilde buz gibi GBSS'ye yerleştirin. (B) Forsepsleri beyinciklere yerleştirin. Beyni orta hattan açın ve hipokampus üzerindeki fazla dokuyu çıkarın. (C) Oklarla gösterildiği gibi hipokampusun altında...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Neşter sapı için bıçaklar	Güzel Bilim Araçları	10011-00
Beyin/Doku Dilim Odası Sistemi	Warner Enstrümanları
Hücre kültürü ekleri, 30 mm, hidrofilik PTFE	Kırlangıç SAS	PICM03050
Konvansiyonel kuluçka makinesi	Termo Bilimsel Heraeus	BB15, Fonksiyon Hattı	37 °C ve %5 CO2'ye ayarlayın
D (+) - Glikoz monohidrat	Merck Kırlangıç	1.08342.1000
D-(+)-Glikoz çözeltisi, suda %45	Sigma	G8769
di-Sodyum hidrojen fosfat dihidrat	Merck Milipore	1.06580.1000
Dumont #5 İnce Forseps Biologie Inox	Güzel Bilim Araçları	11254-20
Dumont #5 Forseps Standart Inox	Güzel Bilim Araçları	11251-20
Dumont #7 Forseps Standart Dumoxel	Güzel Bilim Araçları	11271-30
Dumont Medical #7S Forseps Kısa Eğri Inox	Güzel Bilim Araçları	11273-22
Gentamisin stok çözeltisi, 50 mg / mL	Thermo Fisher Bilimsel	15750-037
Gey'in Dengeli Tuz Çözeltisi (GBSS)	Biyolojik Endüstriler	01-919-1A
Cam Elektrotlar	Bilim Ürünleri	GB150F-10	Yuvarlak ipuçları ev yapımı
Cam Pastör pipetleri, 230 mm	VWR Uluslararası	612-1702
At Serumu, Isı İnaktive Edilmiş (HS)	Thermo Fisher Bilimsel	26050-088
İris Spatula Kavisli	Güzel Bilim Araçları	10092-12
Laboratuvar Kültürü Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini	HERASafe	HS 12
L-Glutamin çözeltisi 200 mM (Q)	Thermo Fisher Bilimsel	25030-024
Nörobazal-A Orta (NBA)	Thermo Fisher Bilimsel	10888-022
Opti-MEM® I İndirgenmiş Serum Ortamı	Thermo Fisher Bilimsel	31985-047
Platin 5 bıçak	Gür
Kalitatif Filtre Kağıdı, Selüloz, Grade 1, 55 mm	Ne adam	1001-055	Orta tutma 11μm
Kalitatif Filtre Kağıdı, Selüloz, Grade 1, 90 mm	Ne adam	1001-090	Orta tutma 11μm
Neşter sapı	Güzel Bilim Araçları	91003-12
TC ile İşlem Görmüş Steril 6 Kuyulu Plakalar	Corning	CORN3516
Sıcaklık kontrolörü	MEDİKAL SİSTEMLER A.Ş.	TC-102
Doku Doğrayıcı	Mickle Laboratuvar Mühendislik A.Ş. LTD.	MTC/2	350 μm'ye ayarlayın