Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. NK hücre izolasyonu, kültürü ve stimülasyonu
- Bozulmamış nosiseptör nöron oluşturun (littermat kontrolü; TRPV1wt::D TAfl/wt) ve ablasyonlu (TRPV1cre::D TAfl/wt) fareler, lox-stop-lox-difteri toksin farelerini (DTAfl/fl) TRPV1cre/wt farelerle çaprazlayarak.
- CO2 inhalasyonunu kullanarak, saf bir littermat kontrol (TRPV1wt: :D TAfl / wt) faresine ötenazi yapın.
- Dalağı, 500 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
- Dalağı bir havaneli kullanarak homojenize edin.
- Hücreleri 1 mL steril PBS ile seyreltin.
- Karışımı 50 μm'lik bir hücre süzgecinden 15 mL'lik konik bir tüpe süzün
.
- Sesi (10 mL) steril PBS ile doldurun.
- 10 μL toplayın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
- Hücreleri santrifüjleyin (500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri, takviye edilmiş bir RPMI 1640 ortamında 108 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
- Bir fare NK hücre izolasyon kiti kullanarak dalak Doğal Öldürücü (NK) hücrelerini manyetik olarak saflaştırmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Akış sitometrisi kullanarak NK hücre saflığını onaylayın.
- 10 μL toplayın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
- Hücreleri santrifüjleyin (500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı çıkarın.
- NK hücrelerini, takviye edilmiş bir RPMI 1640 kültür ortamında (IL-2 ve IL-15 içeren) yeniden süspanse edin.
- Kültür 2 × 106 NK hücre / mL, 48 saat boyunca 96 oyuklu bir U-alt plakada.
2. DRG nöron izolasyonu ve kültürü
- NK hücre stimülasyonunun bitiminden 24 saat önce (adım 1.15), 96 oyuklu bir plakayı 100 μL / kuyu laminin (1 ng / mL) ile kaplayın ve 45 dakika (37 ° C) inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukların bir biyogüvenlik kabininde kurumasına izin verin.
- CO2 inhalasyonunu kullanarak, nosiseptör nöronu bozulmadan ötenazi yapın (littermat kontrolü; TRPV1wt::D TAfl/wt) veya ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) fareler.
NOT: CO2 inhalasyonu, DRG'ye (Dorsal kök ganglionu) bağlı omurilik sinirlerinin bozulmasını önlediği için servikal çıkığa tercih edilir.
- Fareyi tahtaya yüzüstü pozisyonda sabitleyin, cildi kaldırın ve cildi sırt sütunu boyunca kesin.
- Lumbosakral eklemi kesin ve sakrumu lomber omurgadan makasla ayırın.
- Omurganın her iki yanındaki kasları ve kaburgaları kafatasının tabanına ulaşılana kadar kraniyal yönde keserek omurgayı ayırın.
- Makas kullanarak, atlanto-oksipital eklemdeki omurgayı kesin.
- Omurgadan kas ve yağ dokusunu çıkarın.
- Omuriliği çıkarmak ve DRG'ye erişmek için vertebral sütunu sabitleyin ve açın. Dorsal kök yoluyla omuriliğe bağlı ancak meninkslerden ayrılmış intervertebral foraminada DRG'yi arayın.
- DRG'leri, 10 mL buz gibi soğuk takviyeli DMEM ile doldurulmuş 15 mL'lik konik bir tüpe hasat edin.
- Preparasyonu santrifüjleyin (200 × g, 5 dakika, oda sıcaklığı) ve süpernatanı çıkarın.
- Kollajenaz IV (1 mg / mL) ve Dispas II (2.4 U / mL) içeren 250 μL PBS ekleyin.
- DRG'yi Kollajenaz IV / Dispas II (C / D) çözeltisi (80 dakika, 37 ° C, hafif çalkalama) ile inkübe edin. Birkaç fareden gangliyonları toplarken, ganglion başına 125 μL C / D çözeltisi oranını koruyun.
- Enzimleri inaktive etmek için 5 mL takviye edilmiş DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) ortamı ekleyin.
- Çözeltiyi santrifüjleyin (200 × g, 5 dakika) ve süpernatanı bir pipet kullanarak nazikçe çıkarın.
- İstenmeyen hücre kaybını önlemek için, süpernatanın ~ 100 μL'sini bırakın.
- 1 mL takviye edilmiş DMEM ortamı ekleyin.
- Bir pipet tabancası ve azalan boyutlarda üç cam Pasteur pipeti kullanarak, DRG'yi tek hücreli bir preparat haline getirin (Pasteur pipet boyutu başına ~ 10 yukarı / aşağı).
- Bir biyogüvenlik kabininde, sığır serum albüminini (BSA) steril PBS (Fosfat tamponlu salin) içinde %15'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. 1 mL alikotları -20 °C'de saklayın.
- 2 mL steril PBS ekleyerek ve tüpün dibine 1 mL %15 BSA solüsyonunu yavaşça dağıtarak 15 mL'lik konik bir tüpte bir BSA gradyanı oluşturun. Pipeti nazikçe çıkararak gradyanı bozmaktan kaçının.
- Bir P200 pipeti kullanarak, tritüre gangliyon süspansiyonunu (nöronları içeren) tüpün yan tarafına gradyan içine yavaşça pipetleyin.
- Nöron içeren BSA gradyanını (200 × g, 12 dakika, oda sıcaklığı) santrifüjleyin. Santrifüjün hızlanmasını ve yavaşlamasını minimum hıza ayarlayın.
NOT: Santrifüjlemeden sonra, nöronlar tüpün dibinde olacak, hücre kalıntıları ise BSA gradyanında sıkışıp kalacaktır.
- Bir pipet kullanarak tüm süpernatanı nazikçe çıkarın.
- Hücreleri 500 μL Neurobazal içinde yeniden süspanse edin.
- Plaka 10Laminin kaplı, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 4 nöron (200 μL nörobazal / kuyu).
NOT: Ortalama olarak, bir araştırmacı fare başına ~ 8 kuyu doldurabilecektir.
- Bağlanmaya izin vermek için nöronları (37 ° C, gece boyunca) kültürleyin.
3. Ortak kültür
- Nörobazal'ı nöron kültüründen yavaşça çıkarın.
- IL-2 ve IL-15 ile 48 saatlik stimülasyondan sonra (bkz. adım 1.14-1.15), NK hücrelerini yeniden süspanse edin ve nöron kültürüne (96 oyuklu düz alt plaka) 105 NK hücresi/kuyusu ekleyin.
NOT: Ortalama olarak, araştırmacı fare başına ~ 6 kuyu doldurabilecektir.
- Hücreleri takviye edilmiş nörobazal MX'de (37 ° C, 48 saat) birlikte kültürleyin.
