Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarının İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Kaynak: Er, S., et al. Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarında Önceden Oluşturulmuş Fibril Kaynaklı α-Sinüklein Birikiminin İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2020).

Video, fare embriyolarının orta beyninden dopamin nöronlarını izole etme ve kültürleme sürecini göstermektedir. İzole edilmiş ventral orta beyin tabanları enzimler kullanılarak ayrıştırılır. Elde edilen dopamin nöronları toplanır ve çok kuyulu plakalar içindeki mikro adalara aktarılır. Hücreler, mikro adaların içinde yüksek yoğunlukta tutmak için bir dopamin nöron ortamı ile inkübe edilir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hazırlık

1. %0.46 D-glikoz, %1 L-glutamin, %1 N2, %0.2 primosin içeren dopamin nöron ortamı (DPM) hazırlayın, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı/besin karışımı F-12 (DMEM/F12) ile tamamlayın. Malzemeleri karıştırdıktan sonra DPM'yi filtreleyin. DPM'yi 4 °C'de saklayın ve her bir alikotu yalnızca bir kez ısıtın.
   not: DPM, dopamin nöronlarında α-sinüklein birikimini azaltacağı için Glial hücre hattından türetilmiş büyüme faktörü (GDNF) içermemelidir.
2. Son derece hidrof....

Sonuçlar

Şekil 1: E13.5 fare embriyosundan orta beyin tabanının diseksiyonu. (A) Başın arka kısmındaki kesme yerleri siyah oklar ve beyaz kesikli çizgilerle işaretlenmiştir. (B) Parça, embriyonun geri kalanından çıkarıldı. Çıkarılan parça daire içine alınır. (C) Parça, arka tarafı gözlemciye bakacak şekilde 90° döndürüldü. (D) Parça siyah okla.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.4 Tripan Mavi leke	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	15250061
15 ml CELLSTAR Polipropilen tüp	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Almanya	188261
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	10236276001
5 milyon HCl	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
5 M NaOH	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
96 kuyulu ViewPlate (Siyah)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Amerika Birleşik Devletleri	6005182
%99,5 Etanol (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlandiya	Yok
AquaSil Silikonlaştırıcı Sıvı	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	TS-42799
Otoklavlanmış 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
Bioruptor sonikasyon cihazı	Diagenode, Liege, Belçika	B01020001
Ca2+, Mg2+ içermeyen Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	14175-053
CellProfiler ve CellAnalyst yazılım paketleri	Yok	Yok	Ücretsiz açık kaynaklı yazılım
Santrifüj 5702	Eppendorf AG, Hamburg, Almanya	5702000019
CO2 İnkübatör	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	Yok
Sayma odası	BioRad Inc., Herkül, Kaliforniya, ABD	1450015
DeltaVision Ultra Yüksek Çözünürlüklü Mikroskop, hava tablalı ve kabinli	GE Sağlık Yaşam Bilimleri, Boston, Massachusetts, ABD	29254706
Deoksiribonükleaz-I (Dnase I)	Roche, Basel, İsviçre	22098700
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	21331-020
Dulbecco'nun tamponu	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	10500056
D-glikoz	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	G8769
Fosfohat: Tampon Salin (PBS)	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
Çuha çiçeği	InvivoGen, San Diego, Kaliforniya, ABD	KARINCA PM-1, KARINCA PM-2
poli-L-ornitin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	P4957 Serisi
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	11332481001
tripsin	MP Biyomedikal, Valiant Co., Yantai, Shandong, Çin	2199700

Tezli Mali İşler Serisi Serisi Serisi