Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarının İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Kaynak: Er, S., et al. Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarında Önceden Oluşturulmuş Fibril Kaynaklı α-Sinüklein Birikiminin İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2020).

Video, fare embriyolarının orta beyninden dopamin nöronlarını izole etme ve kültürleme sürecini göstermektedir. İzole edilmiş ventral orta beyin tabanları enzimler kullanılarak ayrıştırılır. Elde edilen dopamin nöronları toplanır ve çok kuyulu plakalar içindeki mikro adalara aktarılır. Hücreler, mikro adaların içinde yüksek yoğunlukta tutmak için bir dopamin nöron ortamı ile inkübe edilir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hazırlık

1. %0.46 D-glikoz, %1 L-glutamin, %1 N2, %0.2 primosin içeren dopamin nöron ortamı (DPM) hazırlayın, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı/besin karışımı F-12 (DMEM/F12) ile tamamlayın. Malzemeleri karıştırdıktan sonra DPM'yi filtreleyin. DPM'yi 4 °C'de saklayın ve her bir alikotu yalnızca bir kez ısıtın.
   not: DPM, dopamin nöronlarında α-sinüklein birikimini azaltacağı için Glial hücre hattından türetilmiş büyüme faktörü (GDNF) içermemelidir.
2. Son derece hidrofobik olan silikonlu cam pipetler hazırlayın, böylece embriyonik nöronların ilk kullanımı sırasında yüzeye yapışmayı ve hücre kaybını en aza indirin.
   1. 1 L damıtılmış suya 10 mL silikonlama sıvısı ekleyin ve 2 L'lik bir kapta karıştırarak karıştırın. Cam pipetleri 15 dakika silikonlama solüsyonuna batırılmış halde bırakın.
   2. Pipetleri 3-5x damıtılmış suyla durulayın. Kurutmayı hızlandırmak için pipetleri gece boyunca oda sıcaklığında (RT) veya 100-120 °C ısıtılmış steril alanda 1-2 saat kurutun.
   3. Pipetleri kapalı bir otoklav torbasında standart otoklavlama ile sterilize edin.
3. Nöronların tohumlanması için kullanılacak 96 oyuklu plakanın orta kuyucuklarına 60 μL PO çözeltisi ekleyerek, kenar etkilerini önlemek için plakanın kenarlarında en az bir sıra / sütun kuyucuk bırakarak şeffaf tabanlı poli-L-ornitin (PO) kaplı 96 kuyulu plakalar hazırlayın. Kaplanmış plakayı gece boyunca 4 °C'de veya RT'de 4 saat tutun.
4. Hücreleri kaplamadan önce, PO'yu tamamen aspire edin ve hücreleri 100 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın. Kuyucuklardan 1x PBS aspire edin ve tam kurutma için plakanın kapağını açık tutun.
   not: Kullanılmış PO'yu toplamak ve yeniden kullanmak için filtrelemek mümkündür. Bu, aynı PO çözeltisi için iki kez tekrarlanabilir.
5. Önceden kaplanmış kuyucuklara 50 μL DPM ekleyin. DPM'yi kuyucuklardan 100 μL'lik bir plastik uçla aspire edin ve aynı anda her bir kuyunun çevresindeki kaplamayı çıkarmak için kuyunun tabanını dairesel hareketlerle çizin. Kuyunun ortasında PO kaplı bir ada kalacaktır.
6. Laminer bir başlık altında, mikro adalar oluşturmak için kaplanmış her adanın ortasına 10 μL DPM ekleyin.
   not: DPM kaplı mikro adalara sahip bir plaka, hücrelerin izolasyonu sırasında laminer akış başlığının altında 1-2 saat tutulabilir

2. Embriyonik gün 13.5 (E13.5) fare embriyolarından ventral orta beyin tabanının izolasyonu

1. Diseksiyondan önce, 10 cm'lik bir Petri kabını Dulbecco'nun tamponu ile doldurun ve buz üzerinde tutun.
2. Kurumun yönergelerine göre bir E13.5 hamile dişi fareye ötenazi yapın. Fareyi sırt üstü düz bir şekilde yerleştirin ve ön gövdeye %70 etanol püskürtün. Forseps ile rahim üzerindeki cildi kaldırın ve uterusu ortaya çıkarmak için cerrahi makasla bir kesi yapın.
3. Rahmi dikkatlice çıkarın ve önceden hazırlanmış Petri kabına buz üzerine yerleştirin.
4. RT'de laminer kaputun altında cerrahi makas kullanarak, embriyoları uterustan dikkatlice çıkarın. Embriyolardaki tüm plasenta kalıntılarını forseps ile çıkarın ve bunları Dulbecco'nun tamponu ile doldurulmuş 10 cm'lik yeni bir Petri kabına yerleştirin.
5. Diseksiyon forseps veya iğneleri kullanarak, Şekil 1A'da siyah oklarla işaretlenmiş yerlerden başın arka kısmını kesin. Kesilen parçayı embriyonun geri kalanından uzaklaştırın (Şekil 1B).
6. Kesilen parçanın arka tarafını gözlemciye doğru yerleştirin (Şekil 1C) ve kaudalden kraniyal doğruya doğru yavaşça kesin (Şekil 1D). Kraniyal açıklığın 0,5 mm altından, Şekil 2E'de gösterilen 3 mm² –3^mm2 bölgesini kesin.
7. Ventral orta beyin tabanını (bkz. Şekil 1F) 1.5 mL'lik boş bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Mikrosantrifüj tüpünü, tüm orta beyin tabanları içinde toplanana kadar buz üzerinde tutun.
   not: Alternatif olarak, tüm embriyo beyinlerinin diseksiyonundan sonra orta beyin tabanları 1 mL'lik bir mikropipet ile toplanabilir.

3. E13.5 fare embriyolarından 96 oyuklu plaka formatında birincil embriyonik orta beyin kültürlerinin oluşturulması

1. Aynı 1.5 mL'lik tüpteki tüm embriyolardan orta beyin tabanlarının toplanmasından sonra, kalan Dulbecco'nun tamponunu çıkarın ve doku parçalarını 500 μL Ca2 ⁺, Mg2 ⁺ içermeyen Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile üç kez yıkayın.
2. HBSS'yi çıkarın ve tüpe 500 μL% 0.5 tripsin ekleyin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
3. İnkübasyon sırasında, 1.5 mL fetal sığır serumunu (FBS) 37 ° C'de ısıtın, FBS'ye 30 μL DNaz I ekleyin ve karıştırın. Ayrıca, silikonlu bir cam pipetin ucunu ateşle parlatın. Deliğin keskin kenarları olmadığından ve 1 mL mikropipet ucuyla yaklaşık aynı boyutta olduğundan emin olun.
   not: Alternatif olarak, öğütme için düşük yapışma özelliğine sahip 1 mL mikropipet ucu kullanılabilir. Bununla birlikte, silikonlu cam pipetler en iyi sonuçları veriyor gibi görünmektedir.
4. Adım 3.2'deki inkübasyon biter bitmez, kısmen sindirilmiş dokuya 500 μL FBS/DNaz karışımı ekleyin. FBS / tripsin karışımındaki dokuyu ezmek için cam pipeti kullanın. Dokular küçük, zar zor görülebilen parçacıklara ayrılana kadar tritüre edin. Öğütme sırasında kabarcıklardan kaçının.
5. Kalan parçacıkların yerçekimi ile mikrosantrifüj tüpünün dibinde çökelmesine izin verin. Alttaki çökeltiyi pipetlemeden, süpernatanı 15 mL'lik boş bir konik polipropilen tüpe toplayın.
6. FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) elde etmek için FBS/DNase I'i adım 3.3'ten (98:2) 1.000 μL HBSS ile seyreltin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Mikrosantrifüj tüpünde kalan parçacıklara 1.000 μL yeni karışım ekleyin. Tekrar ezin ve adım 3.5'i tekrarlayın.
7. Tüm FBS/ DNase-I/HBSS'yi (49:1:50) kullanmak için önceki adımı bir kez daha tekrarlayın.
8. Tüm süpernatant 15 mL'lik tüpün içinde toplandıktan sonra (3.5, 3.7 ve 3.8. adımlardan), süpernatanı (~ 3 mL) 5 dakika boyunca 100 x g'da döndürmek için bir masa üstü santrifüj kullanın. Alttaki peletlenmiş hücrelere dokunmadan süpernatanı çıkarın.
9. Tüpe 2 mL DPM ekleyerek hücre peletini yıkayın ve 5 dakika boyunca 100 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın ve peletlenmiş hücrelerdeki kalıntıları en aza indirmek için yıkamayı 2 kez tekrarlayın.
   not: Kültürlenmiş nöronlar için her zaman taze, ısıtılmış DPM kullanın. Yıkama adımları için DPM'nin taze olması gerekmez, ancak 37 °C'ye önceden ısıtılmalıdır.
10. Hücreleri taze, ılık DPM ile seyreltin ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Seyreltme için DPM miktarı, doku diseksiyonu için kullanılan embriyo sayısına bağlıdır. Örneğin, on embriyodan elde edilen hücreleri seyreltmek için 150 μL DPM kullanın.
11. DPM'deki 10 μL hücreyi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bunları 10 μL% 0.4 Tripan mavisi lekesi ile karıştırın. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak canlı (yani Tripan mavisi negatif) hücreleri sayın.
    not: Kuyu başına ~ 1.000 dopamin nöronu elde etmek için oyuk başına kaplama için 30.000 hücre kullanın. Hücre yoğunluğu 6 μL'de ~ 30.000 hücreden yüksekse, tohumlama hacmi 6 μL'den az olmayacak şekilde kaplamadan önce hücreleri DPM ile daha da seyreltin.
12. Kuyuların dibine dokunmadan, DPM'yi adım 1.6'da oluşturulan mikro adalardan çıkarın.
13. Her bir oyukta tekrarlanabilir hücre yoğunluğu elde etmek için, kuyucukta kaplamadan önce hücreleri nazikçe pipetleyerek karıştırın. 1-10 μL'lik bir mikropipet ile, her bir eski mikro adanın bulunduğu yere, kuyunun ortasına 6 μL hücre ekleyin.
14. Nöronal kültürler içeren kuyucuklardan buharlaşmayı en aza indirmek için plakanın kenarlarındaki boş kuyuları 150 μL su veya 1x PBS ile doldurun. Plakayı bir inkübatörde 37 °C'de,% 5 CO₂ 1 saat inkübe edin.
15. 1 saat sonra, plakayı inkübatörden çıkarın, hücrelerle birlikte her bir oyuğa 100 μL DPM ekleyin ve inkübatöre geri yerleştirin.
16. Kaplamadan iki gün sonra (in vitro 2 veya DIV2 günü), 25 μL'yi çıkarın ve nihai ortam hacmini 150 μL'ye getirmek ve buharlaşmayı mümkün olduğunca önlemek için 75 μL taze DPM ekleyin.
17. DIV5'te ortamın yarısını taze DPM ile değiştirin (yani, 75 μL'yi çıkarın ve 75 μL taze DPM ekleyin). DIV5'ten sonra herhangi bir medya değişikliği yapmayın.

Sonuçlar

Şekil 1: E13.5 fare embriyosundan orta beyin tabanının diseksiyonu. (A) Başın arka kısmındaki kesme yerleri siyah oklar ve beyaz kesikli çizgilerle işaretlenmiştir. (B) Parça, embriyonun geri kalanından çıkarıldı. Çıkarılan parça daire içine alınır. (C) Parça, arka tarafı gözlemciye bakacak şekilde 90° döndürüldü. (D) Parça siyah okla...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.4 Tripan Mavi leke	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	15250061
15 ml CELLSTAR Polipropilen tüp	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Almanya	188261
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	10236276001
5 milyon HCl	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
5 M NaOH	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
96 kuyulu ViewPlate (Siyah)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Amerika Birleşik Devletleri	6005182
%99,5 Etanol (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlandiya	Yok
AquaSil Silikonlaştırıcı Sıvı	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	TS-42799
Otoklavlanmış 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
Bioruptor sonikasyon cihazı	Diagenode, Liege, Belçika	B01020001
Ca2+, Mg2+ içermeyen Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	14175-053
CellProfiler ve CellAnalyst yazılım paketleri	Yok	Yok	Ücretsiz açık kaynaklı yazılım
Santrifüj 5702	Eppendorf AG, Hamburg, Almanya	5702000019
CO2 İnkübatör	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	Yok
Sayma odası	BioRad Inc., Herkül, Kaliforniya, ABD	1450015
DeltaVision Ultra Yüksek Çözünürlüklü Mikroskop, hava tablalı ve kabinli	GE Sağlık Yaşam Bilimleri, Boston, Massachusetts, ABD	29254706
Deoksiribonükleaz-I (Dnase I)	Roche, Basel, İsviçre	22098700
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	21331-020
Dulbecco'nun tamponu	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD	10500056
D-glikoz	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	G8769
Fosfohat: Tampon Salin (PBS)	Yok	Yok	Medya Mutfağı, Biyoteknoloji Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi
Çuha çiçeği	InvivoGen, San Diego, Kaliforniya, ABD	KARINCA PM-1, KARINCA PM-2
poli-L-ornitin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	P4957 Serisi
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	11332481001
tripsin	MP Biyomedikal, Valiant Co., Yantai, Shandong, Çin	2199700

Tezli Mali İşler Serisi Serisi Serisi