Meyve Sineği Larva Beyin Eksplantlarının Diseksiyonu ve Montajı

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Larva Beyin Eksplantlarının Diseksiyonu ve Montajı

1. Fizyolojik dış tuzlu su çözeltisinde (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mM Glikoz, 10 mM Sükroz, 5 mM N- [Tris(hidroksimetil)metil]-2-aminoetansülfonik asit (TES), 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 2 mM Ca^{2 +}, pH 7.2) içinde larva beyinlerini diseksiyon mikroskobu altında (4.5x büyütme gücü) iki çift #5 standart uç diseksiyon forseps (11 cm) ile. Larva gövdesini yerinde tutmak için bir çift forseps kullanın ve diğerini beyni dikkatlice incelemek için kullanın. Göz disklerini, beyin loblarını ve ventral sinir kordonunu koruyun. Görüntüleme sırasında numune hareketlerini en aza indirmek için bağlı kasları çıkarın.
2. Bir cam slayt (25 x 75 x 1.0 mm³) hazırlayın ve vakumlu gres ile kare bir oda çizmek için bir şırınga kullanın.
3. Yağ bariyerli kare hazneye 20 μL harici tuzlu su çözeltisi ekleyin.
4. Disseke edilmiş larva beyinlerini forseps kullanarak cam slayt üzerindeki odaya aktarın. Sırt tarafının yukarı baktığından emin olmak için diseksiyon kapsamı altındaki beynin konumunu ayarlayın.
5. Hazneyi bir cam kapak kılıfı (22 x 22 x 0.15 mm³) ile örtün. Larva beyni şimdi dış tuzlu su çözeltisi ile dolu bir oda içindeki kızağa monte edilmiştir (Şekil 1B).
   not: Lameli üzerine hafifçe bastırmak beyni sınırlar ve sonraki görüntüleme seansında numune sürüklenmesini azaltır.

Şekil 1: Dendrit dinamiği görüntüleme ve miktar tayini protokolünün iş akışı. (A) Protokol, numune hazırlama, görüntü toplama, görüntü işleme ve dendrit dinamiğinin yarı otomatik miktar tayinini kapsayan altı adım içerir. (B) Sırt tarafı yukarı bakacak şekilde monte edilmiş bir larva beyin eksplantı içeren bir görüntüleme odasını gösteren şematik bir diyagram. Beyin eksplantı, her lobda ayrı ayrı etiketlenmiş bir ventral lateral nörona (LNv) sahiptir ve harici tuzlu su çözeltisine daldırılır. Vakumlu gres bariyerleri, lamel ağırlığını destekler ve beynin hareket etmesini önleyen küçük bir oda oluşturur.