İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin Nöral Progenitör Hücrelere Farklılaşması

Özet

Kaynak: Phillips, A. W., et al. Fizyolojik olarak ilgili tahliller kullanılarak 3 boyutlu kök hücre kültürlerinin sorgulanması için HiPSC türevli serum serbest embriyoid cisimciklerinin geliştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017).

Video, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSC'ler) nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) ayırmak için bir tekniği göstermektedir. Başlangıçta, hiPSC'ler, fare embriyonik fibroblastlarının (MEF'ler) besleyici bir tabakası üzerinde kültürlenir. Daha sonra, hücreler ayrılır ve MEF'lerin hiPSC'lere yapışmasını ve onlardan ayrılmasını sağlamak için biyopolimer kaplı bir plakaya aktarılır. Askıda kalan hiPSC'ler daha sonra bir V-tabanlı plakaya aktarılır ve agregalar oluşturmak için santrifüjlenir. Son olarak, bir farklılaşma ortamının eklenmesi, agrega içindeki hiPSC'lerin NPC'lere farklılaşmasına neden olur.

Protokol

1. Nöral Progenitör Hücrelerin Oluşumu

1. Fibroblastlardan ve periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) türetilen hiPSC'leri, küçük moleküllerle desteklenmiş insan iPSC ortamında γ ışınlanmış fare embriyonik besleyici (MEF) hücre tabakası üzerinde 6 oyuklu plakalarda koruyun.
   NOT: Günlük bakım, daha önce bildirilen prosedürlerin değiştirilmiş bir versiyonudur.
   1. 300 μL/iyi tavsiye edilen ortamda (üreticinin protokolüne göre) 6 oyuklu doku kültürü dereceli plakanın her bir oyuğuna 6 x 10⁵ MEF plakasını yerleştirin.
   2. 48 saat sonra, hiPSC'leri eklemeden önce MEF ortamını 1 saat boyunca 300 μL/kuyucuklu hiPSC ortamıyla değiştirin.
   3. hiPSC'leri 37 °C'lik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözdürün ve yavaşça 1 mL hiPSC ortamını damlatın. hiPSC'leri ve ortamı 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Toplam hacmi 5 mL'ye getirmek için orta ekleyin. 129 x g'da 4 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin, peleti 1: 1.000 konsantrasyonda Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü ile 1 mL hiPSC ortamında nazikçe yeniden süspanse edin.
   4. Hücre süspansiyonunu (tipik olarak 300.000 hücre / kuyuda ekilir) MEF hücre katmanına yerleştirin ve 37 ° C,% 5 CO₂,% 95 nemde inkübe edin.
   5. Bir ışık mikroskobu kullanarak iPSC kültürünü yakından izleyin. 48 saat sonra, spontan farklılaşmayı en aza indirmek için ışık mikroskobu altında pürüzlü kenarları olan, kistik benzeri hale gelen veya sarımsı kahverengi görünen kültürleri çıkarın.
      not: 7-10 gün sonra hiPSC kolonileri oluşmalıdır. Koloniler yuvarlak olmalı, açıkça tanımlanmış sınırlara ve tek tip hücre yoğunluklarına sahip olmalı ve gevşek bir şekilde paketlenmiş düzgün olmayan hücrelerden yoksun olmalıdır.
   6. Kendiliğinden farklılaşmış hücrelerin kültürünü temizlemek için yuvarlak hiPSC kolonilerini manuel olarak seçin. Kolonileri taze MEF katmanlarına yerleştirerek genişletin. Kültürlerin birleşmeye ve donmaya yakın olduğu her 7 günde bir 1:3 oranında genişletin.
2. Hücreleri genişlettikten ve dondurduktan sonra (yedekleme için), %50 - 75 birleşmeye ulaşana kadar plakalar üzerinde hiPSC kolonileri büyütün.
3. Kaplamadan yedi gün sonra, nöral öncü hücre farklılaşması için hiPSC'leri hasat etmek ve hazırlamak için hafif enzimatik işlem (300 μL enzim çözeltisi ile 5-10 dakika) ve hafif ezme (1.000 μL pipet ile 2-4 kez) kullanın.
4. Hücre süspansiyonunu 4 dakika boyunca 129 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve peleti 5 mL insan iPSC ortamında yeniden süspanse edin. MEF'leri ortadan kaldırmak ve hiPSC verimini en üst düzeye çıkarmak için hücre süspansiyonunu 37 ° C'de 1 saat boyunca% 0.1 jelatin kaplı 5 cm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın. Ortamı (yapışmayan hücrelerle birlikte) 5 cm'lik başka bir jelatin kaplı kaba aktarın.
5. Yapışmayan hücreleri bir transfer pipeti kullanarak 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Plakaları 3 mL orta ile nazikçe durulayın ve 15 mL'lik tüpe ekleyin.
6. Hücre süspansiyonunu 4 dakika boyunca 129 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve peleti ortamda nazikçe yeniden süspanse edin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını belirleyin. 96 oyuklu düşük yapışma özelliğine sahip V tabanlı bir plakada 9.000 hücre / kuyu plakası.
7. Plakayı 3 dakika boyunca 163 x g'da santrifüjleyin. Plakayı 37 °C, %95 nem ve %5 CO_2'de inkübe edin. Bir pipet kullanarak, ortamın yarısını çıkararak ve yerine kimyasal olarak tanımlanmış yeni farklılaştırıcı ortam 1 (DM1; Şekil 1; Malzeme Tablosu) 14 gün boyunca.

Sonuçlar

Şekil 1: SFEB'lerin hazırlanmasındaki ilk adımların şematik özeti. iPSC'ler enzimatik bir ayrışma kullanılarak hasat edildikten sonra, 96 oyuklu plakalara kaplanır ve hızlı agregasyonu indüklemek için 3 dakika boyunca 163 x g'da santrifüjlenir. 14 gün sonra, in vitro (DIV) hücre agregaları, 96 oyuklu plakalardan geniş delikli pipetler aracılığıyla hücre kültürü eki içeren 6 oyuklu plakalara aktarılabi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
SFEB Nöronal Farklılaşma Hücre kültürü Ortamı. Reaktif. Bileşen
STEMdiff Nöral İndüksiyon Ortamı (hiPSC Ortamı)	KÖK HÜCRE Teknolojileri	0-5835	250 ml
PluriQ ES-DMEM Ortamı (MEF Ortamı)	Küresel Kök	GSM-2001
DM1 Medya Bileşenleri
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax sıvı, 1:1	Canlandırıcı	10565018	385 ml
Nakavt Serum Değişimi	Canlandırıcı	10828028	% 20 100ml
Kalem/Strep	Canlandırıcı	15140122	5 ml
Glutamax 200mM	Canlandırıcı	35050061	5 ml
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi 10 mM (100X), sıvı	Canlandırıcı	11140050	5 ml
2-Merkaptoetanol (1.000X), sıvı	Canlandırıcı	21985023	900ul
Küçük Moleküller
Y27632 (KAYAi)	Kök	04-0012-10	10 milyon
Bileşenler/Malzemeler
Fare Embriyonik Fibroblastları	Küresel Kök	GSC-6301G
96 kuyu V alt w/Kapaklar	Evergreen	222-8031-01V
StemPro Accutase Hücre Ayrışma Reaktifi	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A1110501
6 kuyu düz dipli	doğan	353046