Serumsuz embriyoid cisimciklerin geliştirilmesi ve bakımı

Özet

Kaynak: Phillips, A. W., et al. Fizyolojik Olarak İlgili Tahliller Kullanılarak 3 Boyutlu Kök Hücre Kültürlerinin Sorgulanması için HiPSC Türetilmiş Serum Serbest Embriyoid Cisimlerinin Geliştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017).

Video, çeşitli serumsuz farklılaşma ortamları veya DM kullanarak nöronal progenitör hücrelerden serumsuz embriyoid cisimleri (SFEB'ler) geliştirme prosedürünü açıklar. DM-2, nöronların olgunlaşmasını ve SFEB'leri oluşturmak için düzenlenmesini kolaylaştırırken, DM-3 daha fazla büyüme bakımı için kullanılır.

Protokol

1. Serumsuz Embriyoid Vücut (SFEB) İndüksiyonu (Şekil 1)

1. 40 μm hücre kültürü eklerini 6 oyuklu plakalara yerleştirin ve agregaları eklemeden en az 1 saat önce 1 mL farklılaşma ortamı 1 (DM1) (Malzeme Tablosu) ekleyin.
2. Nöral progenitör hücre agregatlarını 200 μL genişliğinde bir ağız ucu kullanarak 20 μL ortamla 40 μm hücre kültürü eklerine aktarın ve ortamı DM2 (Malzeme Tablosu) olarak değiştirin.
   not: Hücre kültürü ekleri, kuyunun dibinden hafifçe oturan ve plastik bir çerçeve boyunca asılı duran bir politetrafloroetilen zardan oluşan özel eklerdir. Bu membran biyouyumludur ve üstüne yerleştirilen SFEB'lere besin ve oksijen taşınmasını verimli bir şekilde sürdürebilir. Genellikle bir fare veya sıçandan alınan organotipik hipokampal dilim kültürleri ile kullanılırlar.
   1. 4-6 agregayı bir hücre kültürü ekine aktarın ve agregalar arasında yeterli boşluk bırakın. İnce bir pipet ucu (örn. 200 μL uç) kullanarak mümkün olduğunca fazla çözeltiyi çıkarın.
      NOT: Çözelti SFEB'lerin etrafından çıkarılırken hücre kültürü eki üzerinde hareket edecekleri için SFEB'yi kısa süreliğine rahatsız etmek kabul edilebilir.
   2. Kültürleri 37 °C'de,% 95 nemde ve% 5 CO2'de 1 mL DM2'de tutun. Bir pipet kullanarak, ortamın dörtte üçünü çıkararak ve dörtte üçünü taze ortamla değiştirerek ortamın %75'ini iki günde bir değiştirin. Örneğin, 750 μL ortamı çıkarın ve 750 μL taze ortam ekleyin.
3. 14 günlük kültürden sonra, her gün ve 16 gün daha% 75 orta değişimle DM3 ortamına (Malzeme Tablosu) geçin.
4. Hücre kültürü eklerindeki SFEB'leri 30 günden fazla tutmak için, ortamı 60, 90 ve 120 gün boyunca her gün değiştirin.
   not: SFEB'ler yaklaşık 1.000 μm çapa kadar büyüyecek ve tipik olarak 100-150 μm kalınlığındadır.
5. 200 μL geniş ağızlı pipet ucu kullanarak ortamı nazikçe pipetleyerek SFEB'leri kesici uçtan ayırın. SFEB'leri aktarmak için, gövdeleri pipet ucuna nazikçe emmek için geniş ağızlı bir pipet ucu kullanın. SFEB'yi pipet ucuna yükledikten sonra, nazikçe 12 oyuklu plakalara aktarın ve oyuk başına 300 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.

Sonuçlar

Şekil 1: SFEB Büyümesi ve Genişlemesi Sırasında Orta Değişikliklerin ve Aşamaların Zaman Çizelgesi.

SFEB'ler kesici uçlara aktarıldıktan sonra, 14 ve 28 günlük in vitro (DIV) olmak üzere iki orta değişikliğe uğrarlar. Genellikle DIV 30, 60 ve 90'daki deneyler için hasat edilirler. Üst iç kısımlar bu süreçte farklı aşamaları gösterir. Ölçek çubukları = 1...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
SFEB Nöronal Farklılaşma Hücre kültürü Ortamı. Reaktif. Bileşen
STEMdiff Nöral İndüksiyon Ortamı (hiPSC Ortamı)	KÖK HÜCRE Teknolojileri	0-5835	250 ml
PluriQ ES-DMEM Ortamı (MEF Ortamı)	Küresel Kök	GSM-2001
DM1 Medya Bileşenleri
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax sıvı, 1:1	Canlandırıcı	10565018	385 ml
Nakavt Serum Değişimi	Canlandırıcı	10828028	% 20 100ml
Kalem/Strep	Canlandırıcı	15140122	5 ml
Glutamax 200mM	Canlandırıcı	35050061	5 ml
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi 10 mM (100X), sıvı	Canlandırıcı	11140050	5 ml
2-Merkaptoetanol (1.000X), sıvı	Canlandırıcı	21985023	900ul
DM2 Medya Bileşenleri
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax sıvı, 1:1	Canlandırıcı	10565018	500 ml
Glutamax 200mM	Canlandırıcı	35050061	5 ml
Kalem/Strep	Canlandırıcı	15140122	5 ml
N-2 Takviyesi (100X), sıvı	Canlandırıcı	17502048	10 ml
DM3 Medya Bileşenleri
NEUROBAZAL Medium (1X), sıvı	Canlandırıcı	21103049	500 ml
B-27 Takviyesi Eksi A Vitamini (50X), sıvı	Canlandırıcı	12587010	10 ml
Glutamax 200mM	Canlandırıcı	35050061	5 ml
Kalem/Strep	Canlandırıcı	15140122	5 ml
Bileşenler/Malzemeler
	Kırlangıç hücresi	PICM0RG50
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	10010023	500 mL

arası Serisi