Çok Elektrotlu Bir Dizi Üzerinde Desenli Nöronal Devreler Oluşturma

Özet

Kaynak: Kanner, S., et al. İşlevsel Olarak Birbirine Bağlı Devrelerden Oluşan Modüler Nöronal Ağların Tasarımı, Yüzey İşlemi, Hücresel Kaplama ve Kültürlenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, modüler nöronal ağlar oluşturmak için nöronal hücrelerin desenli bir çoklu elektrot dizisi (MEA) üzerinde kültürlenme sürecini göstermektedir. Bu yöntem, nöral sinyal iletimi ve hücresel etkileşimlerin incelenmesine izin verir.

Protokol

1. Çoklu Elektrot Dizisi (MEA) Hazırlama

1. MEA'yı bu sırayla temizleyin (Malzeme Tablosu):
   1. Musluk altında su ile yıkayın ve 3 kez konsantre, enzimatik bir deterjan içinde sonikat yapın.
   2. Damıtılmış suda 3 kez sonikat.
   3. Damıtılmış su ile (davlumbazda, 1.000 μl uç) 3 kez yıkayın ve 30 dakika ultraviyole (UV) altına koyun.
2. Ağ hazırlığının desteklenmesi:
   1. Tasarlanan destek ağı kalıbını hazırlayın.
      1. Polidimetilsiloksanı (PDMS) 12 oyuklu bir plakaya (22 mm çapında) dökün.
      2. PDMS sertleştiğinde, kalıbı çıkarın ve bir neşter kullanarak bir halka şekli oluşturmak için ortada bir delik açın.
      3. MEA'nın ortasına tasarlanmış bir destek ağı kalıbı yerleştirin (Şekil 1A) ve yüzeyin geri kalanını oda sıcaklığında (RT) 2 saat boyunca poli-D-lizin (PDL) ile kaplayın.
   2. PDL'yi bir pipet kullanarak çıkarın ve damıtılmış suyla yıkayın.
   3. Kalıbı çıkarın ve kurumaya bırakın (Şekil 1A).
3. Şablonu MEA ile aşağıdaki şekilde hizalayın:
   1. Şablonu belirtilen mikromanipülatöre yerleştirin. Desenli yapıyı elektrotlara doğru bir şekilde hizalamak için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın ve şablonu MEA yüzeyine yerleştirilene kadar indirin (Şekil 1B).
      not: İyi temizlenmiş bir MEA ile temas, PDMS ile MEA'nın kendisi arasında rekabetçi bir yapışma sağlar.
   2. Mikromanipülatörü kaldırın ve gerekirse, MEA'dan ayrılmasını önlemek için PDMS'nin üzerine az miktarda basınç uygulamak için cımbız kullanın.
   3. Şablonu MEA yüzeyine hafifçe bastırın ve sıkıca takıldığını ve iyi hizalandığını doğrulamak için bir mikroskop kullanın (Şekil 1C-D).
4. MEA'yı 15 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin; şablonun üzerine 1 ml PDL damlatın.
5. Her biri 20 dakika boyunca 2 kez vakum odasına yerleştirin. PDL'yi inkübatörde O/N'yi kurumaya bırakın.
6. Kaplamadan önce, PDMS şablonlarını MEA'lardan çıkarın ve steril su kullanarak yıkayın. 7 dakika UV aydınlatması altında bekletin.

2. Kaplama

1. Bir hemositometre kullanarak kaplama için gereken hücre sayısını hesaplayın
   1. Sayım haznesinin (hemositometre) temiz olduğundan emin olun ve üzerine bir lamel yerleştirin (Temizlemek için alkol kullanın).
   2. 10 μl hücre süspansiyonunu 190 μl kaplama ortamında seyreltin (seyreltme 1:20).
   3. Seyreltilmiş hücrelerden 10 μl'yi sayım odasının kenarına yükleyin ve hücreleri yavaşça pipetleyerek haznenin kendi kendine dolmasına izin verin.
   4. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hemositometre ızgarasını görselleştirin. Doğrudan sayma ile odadaki hücre sayısını belirleyin (sağlıklı hücreler yuvarlak olmalıdır). Kenarları geçenler olmadan büyük karenin içindeki hücreleri sayın.
   5. Hücrelerin konsantrasyonunu hesaplayın:
      Toplam hücre sayısı/1000 μl = Seyreltme faktörü × 10⁴ (hemositometrenin alanı) × sayılan toplam hücre sayısı.
      not: Örneğin, seyreltme faktörü 20 ise ve sayılan toplam hücre sayısı 100:
      100 × 20 × 10⁴ = 0.1 x 10⁷ hücre/1.000 μl veya 1 x 10⁶/100 μL. 0.75 x 10⁶ hücreyi kaplamak için hücrelerden 75 μl çıkarın.
2. Tek bir MEA veya Petri kabı başına kaplama için gereken hücre sayısını alın, toplanmayı önlemek için hücreleri yeniden süspanse edin ve bunları merkezde, desenli alanın üstüne yerleştirin (gerekirse hücreler ortamda seyreltilebilir). MEA için ortasına 100 μl'lik bir damla yerleştirin. Lamel için ortasına 1.000 μl'lik bir damla yerleştirin.
3. Kaplanmış hücreleri 37 ° C'de 40 dakika inkübe edin. Kaplanmış hücrelere, MEA başına 1 ml'ye ve lamel başına 2 ml'ye kadar kaplama ortamı ekleyin.
4. 37 ° C'de tutun ve her 4 günde bir 0.5 Pen-Strep,% 2 B-27 ve% 0.75 glutamax ile zenginleştirilmiş taze büyüme ortamı ile seyreltin.
5. 6/7 DIV'den, adalar arasındaki bağlantıları gördükten sonra, glial aşırı büyümeyi önlemek için ortamı 10 μl / ml FUDR (12.5 ml MEM'de 25 mg deoksiüridin + 62.5 mg üridin) veya başka bir anti-mitotik ajan ile seyreltin.

Sonuçlar

Şekil 1. PDMS, bir MEA üzerinde biriktirme yapıları. (A) Bir MEA üzerine monte edilmiş halka şeklinde (kırmızı okla işaretlenmiş) PDMS kalıbı. Kalıp, destekleyici nöronal ağ için hedeflenen ve kültür alanının çevresinde bulunan alanı kaplamak için kullanılır (bu, MEA'ya monte edilen ve yeşil okla işaretlenen halka ile sınırlıdır). (B) Bir mikromanipülatör kullanılarak bir PDMS şabl...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
PDMS, Sylgard 184	Dow Corning
Nalgene Vakum Odası	Termo	5305-0609
Poli-D-Lizin PDL	Sigma	P7886 Serisi
12 kuyulu kültür plakası	Sigma	CLS3336
5-Floro-2'-deoksiüridin	Sigma	F0503
MEA1060-Inv-BC	Çok Kanallı Sistemler
TC02	Çok Kanallı Sistemler
Kalem Strep	Biyolojik Endüstriler Beit Haemek	03-033-1C
B-27 Uzay Aracı	Gibco (Gibco)	17504044
glutaMAX	Gibco (Gibco)	35050-038
MEM Minimum Temel Orta Kartal	Biyolojik Endüstriler Beit Haemek	01-025-1B
Mikro Elektrot Dizileri 4Q	Çok Kanallı Sistemler	60-4QMEA1000iR-Ti-pr	Temizleme Kılavuzu: http://www.multichannelsystems.com

Serisi Serisi