Yöntem makalesi

Tasarlanmış İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Fonksiyonel Motor Nöronlara Farklılaşması

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Garone, M. G., et al. İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin (iPSC'ler) PiggyBac Vektörleri Kullanılarak Fonksiyonel Spinal ve Kraniyal Motor Nöronlara Dönüştürülmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, insan iPSC'lerini motor nöronlara ayırma sürecini göstermektedir. Gerekçe, belirli transkripsiyon faktörlerini ifade etmek için genetik olarak değiştirilmiş iPSC'lerin kullanılmasını içerir. Doksisiklin içeren bir ortamda kültürlendiğinde, bu antibiyotik transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu tetikler, böylece motor nöron progenitörlerine iPSC farklılaşmasını teşvik eder. Nihayetinde, progenitörler, olgun ve işlevsel motor nöronlar elde etmek için nöronal bir ortamda kültürlenir.

Protokol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İnsan iPSC'lerinin Bakımı

  1. Matris kaplı plakaların hazırlanması
    1. 5 mL'lik bir matris şişesini (Malzeme Tablosuna bakınız) gece boyunca 4 ° C'de çözdürün. Orijinal matris stokları farklı stok konsantrasyonlarında gelir ve alikotlar, veri sayfasında belirtilen seyreltme faktörüne göre yapılır ve bireysel parti için spesifiktir. Matrisin erken jelleşmesini önlemek için flakon ve tüpleri buz gibi soğuk tutmak çok önemlidir. Matrisi buz üzerinde önceden soğutulmuş kriyotüplerde alikotlara dağıtın. Kullanılmayan alikotları -20 °C'de dondurun.
    2. Çözülmesi için yaklaşık 2 saat buzun üzerine bir alikot yerleşt....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AktatazSigma-AldrichA6964-100MLHücre ayrışma reaktifi
B27Miltenyi Biyotec130-093-566Nöronal hücre bakımı için serum içermeyen takviye
BambankerNippon GenetiğiNGE-BB02Burada motor nöron progenitörleri için kullanılan hücre dondurma ortamı
BDNF (BDNF)PreproTech (Hazırlık Teknolojisi)450-02Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör
BlastisitSigma-Aldrich203350Prokaryotlarda ve ökaryotlarda protein sentezini engelleyen nükleosit antibiyotik
BsaSigma-AldrichA2153Sığır Serum Albümini. İmmün boyama deneylerinde antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için bloke edici ajan
CaCl2Sigma-AldrichC3881 SerisiElektrofizyolojik Çözeltiler için Kimyasallar
Corning Matrigel hESC Nitelikli MatrisCorning354277Elektrofizyolojik Çözeltiler için Kimyasallar
CRYOSTEM ACF DONDURMA ORTAMIBiyolojik Endüstriler05-710-1Eİnsan iPSC'ler için dondurma ortamı
D-GlikozSigma-AldrichG5146Elektrofizyolojik Çözeltiler için Kimyasallar
DAPT (DALDIRMAAdipoGen (AdipoGen)AG-CR1-0016-M005Gama sekretaz inhibitörü
DağıtmaGibco (Gibco)17105-041İnsan iPSC'lerinin nazikçe ayrışması için reaktif
DMEM/F12Sigma-AldrichD6421-500MLHücre kültürü için bazal ortam
DoksisiklinSigma-AldrichD9891-1GepB-Bsd-TT-NIL ve epB-Bsd-TT-NIP vektörlerinden transgenlerin ekspresyonunu indüklemek için kullanılır
DS2U SerisiWi HücresiUWWC1-DS2UTicari insan iPSC hattı
GDNF (Yurt İçi Finans SantraliPreproTech (Hazırlık Teknolojisi)450-10Glial kaynaklı nörotrofik faktör
Gibco Epizomal hiPSC HattıThermo Fisher BilimselA18945Ticari insan iPSC hattı
Glutamax (Glutamaks)Thermo Fisher Bilimsel35050038Arttırılmış stabiliteye sahip L-glutamine bir alternatif. Hücre sağlığını iyileştirir.
Hepes BelediyesiSigma-AldrichH4034Elektrofizyolojik Çözeltiler için Kimyasallar
L-askorbik asitLKT LaboratuvarlarıA7210Hücre kültüründe antioksidan olarak kullanılır
LamininSigma-Aldrich11243217001Sinir hücrelerinin in vitro olarak bağlanmasını ve büyümesini teşvik eder
NEAA (NEAA)Thermo Fisher Bilimsel11140035Esansiyel olmayan amino asitler. Hücre büyümesini ve canlılığını artırmak için hücre kültürü ortamı için ek olarak kullanılır.
Neon 100 μL TakımıThermo Fisher BilimselMPK10096Hücre elektroporasyon kiti
Neon Transfeksiyon SistemiThermo Fisher BilimselMPK5000Hücre elektroporasyon sistemi
Nörobazal OrtaThermo Fisher Bilimsel21103049Astrosit besleyici tabakaya ihtiyaç duymadan nöronal hücre popülasyonlarının uzun süreli bakımı ve olgunlaşması için tasarlanmış bazal ortam
NutriStem-XF/FFBiyolojik Endüstriler05-100-1Aİnsan iPSC kültür ortamı
PbsSigma-AldrichD8662-500MLDulbecco'nun Fosfat Tamponu Salin, Kalsiyumlu, Magnezyumlu
PBS Ca2+/Mg2+ içermezSigma-AldrichD8537-500MLDulbecco'nun Fosfat Tampon Salin, Kalsiyumsuz, Magnezyumsuz
Penisilin / StreptomisinSigma-AldrichP4333-100MLBakterilerden hücre kültürü kontaminasyonunu önlemek için kullanılan penisilin / Streptomisin çözeltisi.
poli-ornitinSigma-AldrichP4957 SerisiSinir hücrelerinin in vitro olarak bağlanmasını ve büyümesini teşvik eder
SU5402Sigma-AldrichSML0443-5 MGVasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2'nin (VEGFR-2) seçici inhibitörü
Triton X-100Sigma-AldrichT87874- (1,1,3,3-Tetrametilbutil) fenil-polietilen glikol, t-Oktilfenoksipolietoksietanol, Polietilen glikol tert-oktilfenil eter. İmmün boyama testlerinde hücre geçirgenliği için kullanılır
Y-27632 (KAYA inhibitörü)Enzo Yaşam BilimleriALX-270-333-M005Rho ile ilişkili, sarmal bobin içeren protein kinazın (ROCK) hücre geçirgen seçici inhibitörü. iPSC'nin sağkalımını artırır
μ-Slayt 8 Kuyusuİbidi80826Sabit hücrelerin üst düzey mikroskobik analizi için destek
Gazetesi Serisi Sertifikası Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi ) Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Human iPSCsMotor Neuron DifferentiationDoxycycline InductionTranscription Factor ExpressionCell DissociationROCK InhibitorNeuronal MediumPiggyBac VectorsProgenitor MaturationFunctional Motor Neurons

İlgili makaleler