Tasarlanmış İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Fonksiyonel Motor Nöronlara Farklılaşması

Abstract

Kaynak: Garone, M. G., et al. İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin (iPSC'ler) PiggyBac Vektörleri Kullanılarak Fonksiyonel Spinal ve Kraniyal Motor Nöronlara Dönüştürülmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, insan iPSC'lerini motor nöronlara ayırma sürecini göstermektedir. Gerekçe, belirli transkripsiyon faktörlerini ifade etmek için genetik olarak değiştirilmiş iPSC'lerin kullanılmasını içerir. Doksisiklin içeren bir ortamda kültürlendiğinde, bu antibiyotik transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu tetikler, böylece motor nöron progenitörlerine iPSC farklılaşmasını teşvik eder. Nihayetinde, progenitörler, olgun ve işlevsel motor nöronlar elde etmek için nöronal bir ortamda kültürlenir.

Protocol

1. İnsan iPSC'lerinin Bakımı

1. Matris kaplı plakaların hazırlanması
   1. 5 mL'lik bir matris şişesini (Malzeme Tablosuna bakınız) gece boyunca 4 ° C'de çözdürün. Orijinal matris stokları farklı stok konsantrasyonlarında gelir ve alikotlar, veri sayfasında belirtilen seyreltme faktörüne göre yapılır ve bireysel parti için spesifiktir. Matrisin erken jelleşmesini önlemek için flakon ve tüpleri buz gibi soğuk tutmak çok önemlidir. Matrisi buz üzerinde önceden soğutulmuş kriyotüplerde alikotlara dağıtın. Kullanılmayan alikotları -20 °C'de dondurun.
   2. Çözülmesi için yaklaşık 2 saat buzun üzerine bir alikot yerleştirin.
   3. Matrisin alikotunu 50 mL'lik konik bir tüpte 20 mL soğuk DMEM / F12 ile seyreltin.
   4. İyice karıştırın ve 1 mL seyreltilmiş matrisi 35 mm'lik tabaklara (diğer tabakların yüzey alanı başına eşdeğer miktarlar) dağıtın.
   5. Kaplamaya izin vermek için seyreltilmiş matris içeren bulaşıkları oda sıcaklığında 1 saat saklayın.
      not: Parafilm ile kapatılmış bulaşıklar 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
2. Stok çözeltisinin (20 mL) hazırlanması ve nazik hücre ayrışma reaktifinin 1x çalışma alikotu (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Tozu PBS'de 10 mg / mL'ye çözün (Ca^{2 +} / Mg^{2 +} ücretsiz)
   2. Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre membranından sterilize edilir.
   3. 20 alikot (her biri 1 mL) hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
   4. Kullanmadan önce, bir alikotu PBS'de (Ca^{2 +} / Mg^{2 +} ücretsiz) 1 mg / mL'ye (1x çalışma alikotları) seyreltin.
      NOT: 1x çalışma alikotu 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.
3. İnsan iPSC'leri geçirmek.
   1. Başlamadan önce: 4 °C'de saklanırsa, matris kaplı plakaları inkübatörde 37 °C'de 20-30 dakika önceden ısıtın. Oda sıcaklığında gereken insan iPSC ortamı miktarını önceden ısıtın (Malzeme Tablosuna bakın). DMEM/F12'yi önceden ısıtın.
   2. Aspirat kültürü ortamı.
   3. iPSC'leri PBS ile durulayın (Ca^{2 +} / Mg^{2 +} içermez).
   4. 1x yumuşak ayrışma solüsyonu ekleyin (35 mm'lik bir tabak için 0,5 mL). 37 °C'de, kolonilerin kenarları plakadan ayrılmaya başlayana kadar, genellikle 3-5 dakika inkübe edin.
   5. iPSC kolonilerini ayırmamaya dikkat ederek nazik ayrışma solüsyonunu aspire edin.
   6. Hücreleri DMEM / F12 (35 mm'lik bir tabak için 2 mL) ile yıkayın ve hücreleri ayırmamaya dikkat ederek aspire edin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
   7. İnsan iPSC ortamı ekleyin (35 mm'lik bir tabak için 1 mL).
   8. Kolonileri bir hücre kaldırıcı ile nazikçe ayırın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
   9. P1000 pipetleyici ile 3-4 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre kümelerini nazikçe kırın.
   10. Süpernatanı matris kaplı plaka(lar)dan aspire edin.
   11. Hücreleri, insan iPSC ortamının uygun kültür hacminde tohumlayın. Bölme oranı satırdan satıra değişebilir ve yaklaşık 1:4-1:8'dir. Ortamı günlük olarak değiştirin.

2. NIL ve NIP ile İndüklenebilir iPSC Hatlarının Oluşturulması

1. Hücre transfeksiyonu
   1. Hücreleri PBS ile durulayın (Ca^{2 +} / Mg^{2 +} ücretsiz).
   2. Hücre ayrışma reaktifi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (35 mm'lik bir tabak için 0.35 mL) ve tek hücreler ayrılana kadar (5-10 dakika) 37 ° C'de inkübe edin.
   3. P1000 pipetleyici ile 3-4 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre ayrımını nazikçe tamamlayın.
   4. 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 10 mL'ye PBS (Ca^{2 +} / Mg^{2 +} ücretsiz) ekleyin. Hücreleri sayın.
   5. 10⁶ hücreyi pelet haline getirin ve 100 μl Tampon R içinde yeniden süspanse edin (hücre elektroporasyon kitine dahildir; Malzeme Tablosuna bakınız).
   6. Transfeksiyon için plazmit DNA ekleyin: 4.5 μg transpoze vektör (epB-Bsd-TT-NIL veya epB-Bsd-TT-NIP12) ve 0.5 μg piggyBac transpozaz plazmiti.
   7. Hücre elektroporasyon sistemi ile üreticinin talimatlarına göre ve daha önce aşağıdaki parametrelerle açıklandığı gibi transfekt yapın: 1.200 V voltaj, 30 ms genişlik, 1 darbe. Hücreleri, 6 mm'lik matris kaplı bir tabakta 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitörü, Malzeme Tablosuna bakınız) ile takviye edilmiş bir insan iPSC ortamında tohumlayın.
2. Antibiyotiklerle seçim
   1. Transfeksiyondan iki gün sonra, kültür ortamına 5 μg / mL blasticidin ekleyin.
   2. Transfekte edilmemiş hücrelerin çoğu, blastisidin seçiminden sonraki 48 saat içinde ölecektir. Transgenleri genoma entegre etmemiş hücreleri seçmek için hücreleri en az 7-10 gün boyunca blasticidin içinde tutun.
   3. Farklı sayıda transgen ve farklı entegrasyon bölgelerine sahip hücrelerden oluşan karışık bir popülasyon olarak stabil bir şekilde transfekte edilmiş hücreleri koruyun veya tek klonları izole edin.
   4. Ngn2 için transgene özgü primerlerle RT-PCR ile 1 μg / mL doksisiklin indüksiyonu üzerine transgenlerin etkili ekspresyonunu kontrol etmek için ek bir tabak hazırlayın (İleri: TATGCACCTCACCCCCATAG; Ters: GAAGGAGGGCTCGACT).
   5. Bu aşamada, yeni NIL- ve NIP-iPSC hatlarının stoklarını insan iPSC'leri için bir dondurma ortamında dondurun (bkz. Malzeme Tablosu).

3. Motor Nöron Farklılaşması

1. Hücreleri tarif edildiği gibi hücre ayrışma reaktifi ile ayırın (adım 2.1.1.-2.1.3.). Ayrışmış hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 5 hacim DMEM / F12 ile seyreltin. Hücreleri pelet haline getirin ve 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş bir insan iPSC ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve 62.500 hücre/^cm2 yoğunlukta matris kaplı tabaklara tohumlayın.
2. Ertesi gün, ortamı 1x stabil L-glutamin analogu, 1x esansiyel olmayan amino asit (NEAA) hücre kültürü takviyesi ve 1 μg/mL doksisiklin içeren 0.5x penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM / F12 ile değiştirin. Bu, farklılaşmanın 0. günü olarak kabul edilir. 1. günde, ortamı ve doksisiklini yenileyin.
3. 2. günde, ortamı 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 ve 1 μg/mL doksisiklin içeren Neurobazal / B27 ortamı (1x B27, 1x stabil L-glutamin analogu, 1x NEAA ve 0.5x penisilin / streptomisin ile desteklenmiş Nörobazal Ortam) olarak değiştirin (bkz. Ortamı ve doksisiklini 5. güne kadar her gün yenileyin.
4. 5. Gün: Hücre ayrışma reaktifi ile hücrelerin ayrışması (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Hücreleri PBS ile durulayın (Ca^{2 +} / Mg^{2 +} ücretsiz).
   2. Hücre ayrışma reaktifi ekleyin (35 mm'lik bir tabak için 0,35 mL) ve tüm hücre tek tabakası tabaktan ayrılana kadar 37 °C'de inkübe edin.
      İnkübasyon sırasında tek hücrelerin ayrılmayacağını unutmayın.
   3. 1 mL DMEM / F12 ekleyin ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
   4. P1000 pipetleyici ile 10-15 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre ayrımını nazikçe tamamlayın.
   5. 4 mL DMEM / F12 ekleyin ve hücreleri sayın.
   6. Bu aşamada, motor nöron progenitörlerini üretici talimatlarına göre bir hücre dondurma ortamında dondurun (Malzeme Tablosuna bakınız).
   7. Hücreleri pelet haline getirin ve 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş Nöronal Ortamda (20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF ve 200 ng/mL L-askorbik asit ile desteklenmiş Nörobazal/B27 ortamı, Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden süspanse edin.
   8. Hücreleri poli-ornitin / laminin üzerine veya alternatif olarak 100.000 hücre /^cm2 yoğunlukta matris kaplı destekler üzerine tohumlayın. İmmün boyama analizi için polimer lamel ile μ-Slide plastik destekler kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız).
5. 6. günde, ortamı ROCK inhibitörü içermeyen taze Nöronal Ortama değiştirin. Sonraki günlerde, ortamın yarısını her 3 günde bir yenileyin. Yüzeyden ayrılmayı önlemek için kültür ortamı çok dikkatli bir şekilde değiştirilmelidir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aktataz	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Hücre ayrışma reaktifi
B27	Miltenyi Biyotec	130-093-566	Nöronal hücre bakımı için serum içermeyen takviye
Bambanker	Nippon Genetiği	NGE-BB02	Burada motor nöron progenitörleri için kullanılan hücre dondurma ortamı
BDNF (BDNF)	PreproTech (Hazırlık Teknolojisi)	450-02	Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör
Blastisit	Sigma-Aldrich	203350	Prokaryotlarda ve ökaryotlarda protein sentezini engelleyen nükleosit antibiyotik
Bsa	Sigma-Aldrich	A2153	Sığır Serum Albümini. İmmün boyama deneylerinde antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için bloke edici ajan
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881 Serisi	Elektrofizyolojik Çözeltiler için Kimyasallar
Corning Matrigel hESC Nitelikli Matris	Corning	354277	Elektrofizyolojik Çözeltiler için Kimyasallar
CRYOSTEM ACF DONDURMA ORTAMI	Biyolojik Endüstriler	05-710-1E	İnsan iPSC'ler için dondurma ortamı
D-Glikoz	Sigma-Aldrich	G5146	Elektrofizyolojik Çözeltiler için Kimyasallar
DAPT (DALDIRMA	AdipoGen (AdipoGen)	AG-CR1-0016-M005	Gama sekretaz inhibitörü
Dağıtma	Gibco (Gibco)	17105-041	İnsan iPSC'lerinin nazikçe ayrışması için reaktif
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Hücre kültürü için bazal ortam
Doksisiklin	Sigma-Aldrich	D9891-1G	epB-Bsd-TT-NIL ve epB-Bsd-TT-NIP vektörlerinden transgenlerin ekspresyonunu indüklemek için kullanılır
DS2U Serisi	Wi Hücresi	UWWC1-DS2U	Ticari insan iPSC hattı
GDNF (Yurt İçi Finans Santrali	PreproTech (Hazırlık Teknolojisi)	450-10	Glial kaynaklı nörotrofik faktör
Gibco Epizomal hiPSC Hattı	Thermo Fisher Bilimsel	A18945	Ticari insan iPSC hattı
Glutamax (Glutamaks)	Thermo Fisher Bilimsel	35050038	Arttırılmış stabiliteye sahip L-glutamine bir alternatif. Hücre sağlığını iyileştirir.
Hepes Belediyesi	Sigma-Aldrich	H4034	Elektrofizyolojik Çözeltiler için Kimyasallar
L-askorbik asit	LKT Laboratuvarları	A7210	Hücre kültüründe antioksidan olarak kullanılır
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Sinir hücrelerinin in vitro olarak bağlanmasını ve büyümesini teşvik eder
NEAA (NEAA)	Thermo Fisher Bilimsel	11140035	Esansiyel olmayan amino asitler. Hücre büyümesini ve canlılığını artırmak için hücre kültürü ortamı için ek olarak kullanılır.
Neon 100 μL Takımı	Thermo Fisher Bilimsel	MPK10096	Hücre elektroporasyon kiti
Neon Transfeksiyon Sistemi	Thermo Fisher Bilimsel	MPK5000	Hücre elektroporasyon sistemi
Nörobazal Orta	Thermo Fisher Bilimsel	21103049	Astrosit besleyici tabakaya ihtiyaç duymadan nöronal hücre popülasyonlarının uzun süreli bakımı ve olgunlaşması için tasarlanmış bazal ortam
NutriStem-XF/FF	Biyolojik Endüstriler	05-100-1A	İnsan iPSC kültür ortamı
Pbs	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Dulbecco'nun Fosfat Tamponu Salin, Kalsiyumlu, Magnezyumlu
PBS Ca2+/Mg2+ içermez	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salin, Kalsiyumsuz, Magnezyumsuz
Penisilin / Streptomisin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Bakterilerden hücre kültürü kontaminasyonunu önlemek için kullanılan penisilin / Streptomisin çözeltisi.
poli-ornitin	Sigma-Aldrich	P4957 Serisi	Sinir hücrelerinin in vitro olarak bağlanmasını ve büyümesini teşvik eder
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5 MG	Vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2'nin (VEGFR-2) seçici inhibitörü
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4- (1,1,3,3-Tetrametilbutil) fenil-polietilen glikol, t-Oktilfenoksipolietoksietanol, Polietilen glikol tert-oktilfenil eter. İmmün boyama testlerinde hücre geçirgenliği için kullanılır
Y-27632 (KAYA inhibitörü)	Enzo Yaşam Bilimleri	ALX-270-333-M005	Rho ile ilişkili, sarmal bobin içeren protein kinazın (ROCK) hücre geçirgen seçici inhibitörü. iPSC'nin sağkalımını artırır
μ-Slayt 8 Kuyusu	İbidi	80826	Sabit hücrelerin üst düzey mikroskobik analizi için destek