İnsan Kornea Fibroblastları ve Nöronlarının 3 Boyutlu Ko-Kültür Modelinin Oluşturulması

Özet

Kaynak: Sharif, R., et al. Kornea Doku Mühendisliği: İnsan Korneasının Stromal-Sinir Etkileşimlerinin İn Vitro Modeli. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, birincil insan kornea fibroblastları ve farklılaşmış nöronal hücrelerden oluşan üç boyutlu bir ko-kültür model sistemi oluşturma tekniğini göstermektedir. Bu ko-kültür sistemi, stromal-sinir etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.

Protokol

1. Primer HCF'ler (insan kornea fibroblastları) Kültür ve 3D Yapı Montajı

1. Daha önce EMEM'de yetiştirilen eksplantlardan %10 FBS %1 Antibiyotik/Antimikotik, HCF'leri geçmek ve saymak için 3D yapıları birleştirmek.
2. 3D yapılardan 0,4 μm gözenekli polikarbonat membran ekleri üzerine yaklaşık 1 x 10⁶ hücre/kuyu birincil HCF'leri ve yapının üstüne 1,5 mL taze EMEM %10 FBS %1 Antibiyotik/Antimikotik tohumlayın. Her yapının altına aynı ortamdan 1,5 mL daha ekleyin.
3. 24 saatlik hücre tohumlamasından sonra, hücreleri EMEM %10 FBS %1 Antibiyotik / Antimikotik ile kültürleyin, 0.5 mM 2-O-α-D-glukopiranosil-L-askorbik asit (C Vitamini) ile uyarıldıktan sonra her yapının üstüne 1.5 mL ve altına 1.5 mL eklenerek.
4. Kültürleri 3 hafta boyunca 37 ° C'de,% 5 CO_2'de bir inkübatörde tutun ve tüm çalışma süresi boyunca her gün taze ortam sağlayın. Başka bir geçişe gerek yoktur.

2. Hücre Farklılaşması ve Ko-kültürler

1. 3 hafta sonra,% 10 FBS,% 1 Antibiyotik / Antimikotik ve 0.5 mM 2-O-α-D-glukopiranosil-L-askorbik asit (C Vitamini) içeren 1.5 mL EMEM içeren önceden monte edilmiş 3D yapıların üstüne 8 x 10³ hücre / kuyu SH-SY5Y insan nöroblastom hücresi ekleyin.
   1. Hücre farklılaşmasını başlatmadan önce SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinin en az 24 saat boyunca kornea stromal hücrelerinin üzerinde büyümesine izin verin.
2. Yapının üzerinde %1 FBS ve 1.5 mL 10 μM Retinoik Asit içeren EMEM ile hücreleri uyararak SH-SY5Y hücre farklılaşmasını başlatın. Yapının altına 1,5 mL EMEM %10 FBS %1 Antibiyotik/Antimikotik 0,5 mM 2-O-α-D-glukopiranosil-L-askorbik asit (C Vitamini) ekleyin. Retinoik Asit adımının karanlıkta yapılması gerektiğini unutmayın.
   1. Bu farklılaşma ortamındaki hücreleri 5 gün boyunca kültürlemeye devam edin.
3. Hücreler farklılaşma fazına ulaştığında, hücreleri 2 nM Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ve EMEM'e eklenen %1 Antibiyotik/Antimikotik içeren 1.5 mL serumsuz ortama geçirin. Yapının altına 1,5 mL EMEM %10 FBS %1 Antibiyotik/Antimikotik 0,5 mM 2-O-α-D-glukopiranosil-L-askorbik asit (C Vitamini) ekleyin. BDNF adımının karanlıkta gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.
4. Daha fazla analiz için işlemeden önce hücreleri 2 gün daha kültürleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Çözeltisi (1X)	Gibco by Life Technologies	14190-144
Steril forseps	Fischer Bilimsel	13-812-42	Fisherbrand Diseksiyon Ekstra İnce Sivri Uçlu Kıymık Forseps
Tek kenarlı tıraş bıçakları	Kişilik	270100
Steril cerrahi neşter bıçakları No.10	Tüy Cerrahi Bıçak	2976#10
Eagle'ın Minimum Temel Ortamı	ATCC (Uzay Servisi)	30-2003
Fetal Sığır Serumu	Atlanta Biyoloji	S11550 Serisi	Medya hazırlığı için %10 FBS gereklidir
Antibiyotik-Antimikotik (100X)	Gibco by Life Technologies	15240-062	Besiyeri hazırlığı için %1 Antibiyotik-Antimikotik gereklidir
% 0.05 Tripsin EDTA (1X)	Gibco by Life Technologies	25300062
0,4 μm gözenekli polikarbonat membran ekler	Corning Yardımcı Yıldızı	3412
2-O-α-Dglukopiranosil-L-askorbik asit (C vitamini)	Sigma-Aldrich	SMB00390-14	Çalışma için 0.5 mM'lik bir konsantrasyon kullanılmalıdır
SH-SY5Y Nöroblastom hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	SHSY5YATCC CRL-2266
Retinoik Asit	Sigma-Aldrich	SRP3014-10UG	10uM'lik nihai konsantrasyon kullanılmalıdır
BDNF (BDNF)	Sigma-Aldrich	R2625-100MG	2nM'lik nihai konsantrasyonun kullanılması gerekir
Dimetil Sülfoksit (DMSO)	VWR-Alfa Aesar	67-68-5	Kullanılacak Ultra Saf Dereceli Steril DMSO
Thermo Scientific Nunc Hücre Kültürü İşlem Görmüş EasYFlask (T25)	Balıkçı Bilimsel	12-565-351
Thermo Scientific Nunc Hücre Kültürü İşlem Görmüş EasYFlask (T75)	Balıkçı Bilimsel	12-565-349

Gazetesi yaş arası Serisi Gazetesi Gazetesi