Kitle Sitometrisini Görüntülemek için Doku İmmün Boyama

Özet

Video, kitle sitometrisini görüntülemek için bir doku örneğinin hazırlanmasını açıklar. Doku ilk önce antijen epitoplarını maskelemek, hücrelere nüfuz etmek ve spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için işlenir. Daha sonra doku, metal konjuge bir antikor kokteyli ve bir nükleer leke ile inkübe edilir. Son olarak, tedavi edilen doku örneği bir optik tarayıcı kullanılarak görüntülenir.

Protokol

1. Doku ön tedavisi:

Taze Dondurulmuş dokular için:

1. Kullanmadan önce en az bir saat boyunca -20°C dondurucuya bir cam Coplin kavanozu koyun.
2. Slaytları -80°C dondurucudan çıkarın ve -20°C dondurucuda en az 15 dakika cam Coplin kavanozuna koyun.
3. Çeker ocak altında, %16 paraformaldehit (PFA) cam ampulü açmak için bir ampul kesici kullanın. Kırık camı uygun şekilde atın.
4. Plastik bir Coplin kavanozuna 10 mL %16 PFA ve 30 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. PBS'nin 4°C'ye kadar önceden soğutulduğundan emin olun.
5. Bu solüsyonu en az 4°C buzdolabına en az 15 dakika aktarın.
6. 15 dakika sonra, slaytlarla birlikte cam Coplin kavanozunu 10 dakika boyunca 4°C buzdolabına aktarın.
7. Slaytları cam kavanozdan soğuk %4 PFA solüsyonu içeren plastik Coplin kavanozuna aktarın.
8. Slaytları 4% PFA ile buzdolabının içinde 30 dakika sabitleyin.
9. Slaytları oda sıcaklığında PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez durulayın ve döngüler arasında iyice durulamayı sağlayın.

FFPE dokuları için:

1. Pozitif yüklü standart mikroskop slaytlarına monte edilmiş 5 μm Formalin ile sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) doku kesitleri ile başlayın.
2. Slaytları 60°C'de bir saat ısıtarak mumdan arındırın.
3. Slaytları çıkarın ve yaklaşık 5 dakika oda sıcaklığına soğutun.
4. Slaytları bir slayt postasına yerleştirin ve iki kez 3 dakika boyunca ksilen banyosunda durulayın.
5. Yine, slaytları %100 etanol ile 1 dakika boyunca iki kez durulayın.
6. Benzer şekilde, slaytları %95 ve %70 etanol içinde her biri 1 dakika durulayın.
7. Son olarak, damıtılmış suda 3 dakika boyunca iki kez son bir durulama yapın.
   not: Hyperion, kayma kenarının 2 mm yakınında ablate olamaz, dokuyu mümkün olduğunca ortalayamaz.

2. Isı kaynaklı epitop alımı (HIER)

1. Tris-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) pH9 tamponunu hazırlayın:
   1. Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Tamponu 100x'te satın alınır ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) suyuna 1x'e seyreltilir.
   2. Örn: 247,5 mL HPLC suya 2,5 mL Abcam ab93684.
      not: Altı aydan eski tampon kullanılmamalıdır.
2. Slaytları ısıtmak için bir örtü açma odası kurun. İlk olarak, haznenin altını 500 mL musluk suyu ile doldurun. Ardından, her iki yan kaba 250 mL musluk suyu ve merkezi kaba 200 mL musluk suyu ekleyin.
3. 5 kişilik slaytlı bir posta göndericisine en fazla 3 slayt yerleştirin.
4. Doku tamamen suya batırana kadar slayt postasını HIER tamponu ile doldurun. not: Buharı boşaltmak ve basınçlanmayı önlemek için sürgülü posta göndericisinin üst kısmında küçük bir delik olduğundan emin olun.
5. "Program 4"ü 95 °C'de 20 dakika çalıştırın.
6. Bu arada, sonraki adımlar için inkübasyon odalarını önceden ısıtın (bkz. adım 3.5)
7. İnkübasyondan sonra, postayı çıkarın ve musluktan soğuk suyla bir küvete koyun.
8. 5 dakika soğumaya bırakın.
9. Tamponun yarısını postadan çıkarın ve damıtılmış su ile değiştirin. 5 dakika soğumaya bırakın.
10. Tamponu kademeli olarak çıkarın ve su hacmini her biri 5 dakikalık bir soğutma süresi ile iki kez artırın.
11. Son olarak, slaytları %100 damıtılmış suda durulayın.

3. Spesifik olmayan bağlamayı engelleme

1. % 0.1 Triton X-10.
   ile 350uL TBS'ye% 10 BSA ile 150uL TBS ekleyerek Bloke Edici Tampon (Tris tamponlu salin veya TBS,% 0.1 Triton X-100,% 3 Sığır serum albümini veya BSA) hazırlayın not: %10 BSA'lı TBS -20 °C'de saklanır ve her seferinde taze olarak çözülmelidir.
2. Bir slayt posta gönderici veya Coplin kavanozları kullanarak, slaytları TBS'de 5 dakika,% 0.1 Triton X-100 iki kez yıkayın.
3. Slaytı postadan çıkarın ve PAP dairesinin dışındaki arabelleği çıkarmak için bir Kim mendili kullanın. Hafifçe kuruması için ~ 1 dakika bekleyin.
4. Bir P200 kullanarak, dokunun üzerine birkaç damla bloke edici tampon ekleyin, sadece onu kaplayacak kadar. PAP hattı sıvıyı doku üzerinde tutmalıdır.
   not: Tampon PAP çemberi içinde sınırlı değilse, daha sonra antikor kaybını önlemek için PAP çemberini dokunun etrafına yeniden çizin.
5. Slaytı oda sıcaklığında bir nem odasında 1 saat inkübe edin.
   not: Boş bir pipet ucu kutusu, bir nem odası için iyi çalışır. Altta az miktarda musluk suyu bulunduğundan emin olun.

4. Metal konjuge antikorlarla boyama

1. Metal konjuge antikorları 4 ° C'den çıkarın ve 1 dakika boyunca 10.000 x G'de santrifüjleyin.
2. TBS, %0.1 Triton X-100 ve %1 BSA karışımında antikor ana karışımının optimal seyreltilmesinin hazırlanması.
   NOT: a) Her bir antikorun optimal seyreltilmesi deneysel olarak belirlenmelidir ve başarılı görüntüleme kütle sitometrisi deneyleri için en kritik adımlardan biridir. Hacimleri hesaplamak için bir Excel elektronik tablosu kullanın. Antikor maliyeti nedeniyle gerekenden biraz daha fazlasını yapın. örneğin, 200 uL blokaj tamponu aldıysa, 250 uL ana karışım yapın. b) Ana karışım, blokaj adımı sırasında her deney için taze olarak hazırlanmalıdır.
3. İnkübasyondan sonra (bkz. adım 3.5), slaydı inkübatörden çıkarın.
4. Slaytı Kim mendillerine dikey ve yatay olarak vurarak fazla engelleme arabelleğini çıkarın. Bu, doku üzerinde bir miktar bloke edici tampon bırakmalıdır, ancak çoğunu çıkaracaktır.
5. Hafifçe kuruması için ~ 1 dakika bekleyin.
6. Slaytı 4°C'deki nem odasına yerleştirin ve dengelenmesini bekleyin.
7. Daha sonra, antikor ana karışımını doku üzerine dikkatlice pipetleyin, çözeltinin PAP çemberi içinde yer almasına son derece dikkat edin.
8. Nem odasını kapatın ve gece boyunca 4°C'de inkübe edin.
9. Gece boyunca inkübasyonun ardından, slaytı 4°C'den çıkarın ve slaytı Kim mendillerine dikey ve yatay olarak vurarak fazla ana karışımı çıkarın.
10. Slaytı posta kutusuna veya Coplin kavanozuna yerleştirin; iki kez% 0.2 Triton X-100 ile desteklenmiş fosfat tamponlu salin veya PBS ile 5 dakika yıkayın.
11. Ardından, slaytı PBS'de iki kez 5 dakika yıkayın. Slaytı çıkarın ve yaklaşık 1 dakika kurumasını bekleyin.

5. DNA İnterkalasyonu

1. DNA İnterkalasyonu için, Intercalator-IR 1:1000'i PBS'de seyreltin.
2. Seyreltilmiş interkalatörü doku üzerine dikkatlice pipetleyin ve çözeltinin PAP çemberi içinde yer aldığına son derece dikkat edin.
3. Blokaj için kullanılan nem odasında oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
4. Bundan sonra, fazla Intercalator-Ir boyasını çıkarmak için slaytları Kim mendillerine dikey ve yatay olarak vurun.
5. Slaytı posta kutusuna veya Coplin kavanozuna yerleştirin ve her biri 5 dakika boyunca HPLC suyla iki kez yıkayın.
6. Taramadan önce slaytları bir kurutucuda 5 dakika kurutun.

6. Görüntü tarama

1. Slayt taraması için, slayta dört soluk X çizerek bir karbür uçlu cam aşındırıcı kullanın. Kesin öğretim noktaları, en iyi görüntü kaydına izin verecektir.
   not: Kenara çok yaklaşmayın.
2. İnç başına en az 1200 nokta olacak şekilde düz yataklı bir belge tarayıcı kullanarak tarayın
3. Bu görüntüyü slayt kenarlıklarına mümkün olduğunca yakın kırpın ve bir flash sürücüye kaydedin.
4. Görüntü ortak kaydı için, dosya adında "Pre_IMC" olan slaydı bir Hamamatsu NanoZoomer'da tarayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Kitle sitometrisinin görüntülenmesi için doku immün boyama prosedürünün şematik gösterimi

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alet -leri
Coplin kavanozları
Havalandırma delikli plastik 5 slaytlı posta gönderici
Antijen alma cihazı (decloaking odası)
tarayıcı
Kimyasallar ve Enzimler:
Ksilen
200 geçirmez etanol
HPLC Su
Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Tamponu
Tbs
% 0.1 Trisyon X-100 ile TBS
%10 BSA ile TBS
Pbs
% 0.2 Trisyon X-100 ile PBS