Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Standart-Yapay Beyin Omurilik Sıvısının (aCSF) Hazırlanması
- Stok Hazırlama Çözelti A
- Kimyasalları eklemeden önce temiz 1 L'lik bir behere 700 ml damıtılmış su ekleyin.
- 500 ml'lik bir hacmi sürekli karıştırırken, 136.75 g NaCl, 6.99 g KCl, 2.89 g MgS04 ve 2.83 g NaH 2PO4 ekleyin.
- 1 L'lik son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin. Seyreltmeden sonra, her bir bileşiğin nihai konsantrasyonu 117 mM NaCl, 4.69 mM KCl, 1.2 mM MgS04 ve 1.18 mM NaH2PO4'tür.
- 4 °C'de 2 haftaya kadar buzdolabında saklayın.
- Stok Çözeltisi B'nin Hazırlanması
- Kimyasalları eklemeden önce temiz bir 1 litrelik behere 700 ml damıtılmış su ekleyin.
- 500 ml'lik bir hacmi sürekli karıştırırken, 41.45 g D-glikoz ve 41.84 gNaHCO3 ekleyin.
- 1 L'lik son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin. Seyreltmeden sonra, her bir bileşiğin nihai konsantrasyonu 11.5 mM D-glikoz ve 24.9 mMNaHCO3'tür.
- 4 °C'de 2 haftaya kadar buzdolabında saklayın.
- Her deneyden önce, 50 ml stok A'yı 50 ml stok B ile karıştırın ve nihai konsantrasyon aCSF çözeltisini elde etmek için damıtılmış su ile 1 L'ye getirin ve en az 30 dakika boyunca karbojen (% 95 O%2 -% 5 CO2 karışımı) ile sürekli oksijenlendirirken RT'de bırakın. Son konsantrasyon aCSF'yi sadece her deneyin başında hazırlayın ve günün sonunda atın.
2. Sükroz-yapay Beyin Omurilik Sıvısının (Sucrose-aCSF) Hazırlanması
- Stok Çözeltisinin Hazırlanması C
- Kimyasalları eklemeden önce temiz 1 L'lik bir behere 700 ml damıtılmış su ekleyin.
- 500 ml damıtılmış suyu sürekli karıştırırken 240 g sakaroz, 6.55 g NaHCO3, 0.671 g KCl, 4.88 g MgCl2, 0.22 g CaCl2 ve 0.21 g askorbik asit ekleyin.
- 1 L'lik son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin. Seyreltmeden sonra, her bir bileşiğin nihai konsantrasyonu 701.1 mM sükroz, 78 mM NaHCO3, 9 mM KCl, 24 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2 ve 1.2 mM askorbik asittir.
- Stok çözeltisi C'yi bir haftaya kadar 4 °C'de tutun.
- Her deneyden önce, son konsantrasyonda sükroz-aCSF çözeltisini elde etmek için 300 ml 50 ml stok C'yi 600 ml damıtılmış su ile karıştırın. En az 30 dakika boyunca sürekli olarak karbojen (%95 O2 - %5 CO2 karışımı) ile oksijenlendirirken RT'de bırakın.
3. Dilim Hazırlama
- 100 ml sakaroz-aCSF çözeltisi içeren temiz bir beheri karbojenle oksijenlendirirken buza yerleştirin ve birkaç damla 0.1 M NaOH çözeltisi (pH 7.4 olduğunda) veya 0.1 M HCl çözeltisi (pH 7.4 olduğunda) eklerken pH'ı bir pH metre kullanarak 7.4>
- Bir vibratomun kesme haznesini sakaroz-aCSF ile doldurun ve oksijenlendirin. Kesme haznesine bağlı gliserol bazlı soğutma sistemini açın ve 0 - 4 °C'ye kadar soğuması için 15 dakika bekleyin.
- Sıçan yavrularını (yetişkin zamanlı gebe Sprague-Dawley sıçanlarından 9 ila 12 yaş arası) Ketamin (70 mg / kg, ip; 50 μl'lik < son hacim kullanılarak) ile uyuşturun. Yavru sakinleştiğinde, kuyruk kıstırma refleksinin olmadığını iki kez kontrol edin.
- Yavruların kafasını kes.
- Karbon çeliğinden bir neşter bıçağı kullanarak kafa derisini önden arkaya doğru uzunlamasına kesin ve forseps kullanarak cildi yanlara doğru çekin. Beyni kaplayan kemiği kesin, makası yanlamasına hareket ettirin ve beyni ortaya çıkarmak için tamamen çıkarın.
- Ardından, bir spatula kullanarak beyni hızla çıkarın (başlangıçta koku alma ampulünün altına yerleştirilerek en rostraldan en kaudal bölgelere doğru nazikçe itin). Beyni nazikçe buzla soğutulmuş oksijenli sükroz-yapay beyin omurilik sıvısına (sakaroz-aCSF) itin.
- Sağ hemisferde parasagital bir kesim yapın (hemisferin yaklaşık üçte birini çıkarın) ve beynin kesilmiş tarafını, pedunkülopontin çekirdeğini (PPN) içeren sagital 400 μm bölümleri kesmek için bir vibrodilimleyicinin kesme odasına manyetik olarak sabitlenecek metalik bir diske yapıştırın. Tüm hücre yama kelepçesi kayıtlarından önce PPN dilimlerini 45 dakika RT'de tutun.
4. PPN Dilimlerinde Gama Bandı Salınımlarının Kayıtları
- Potasyum-glukonat Hücre İçi Çözeltinin Hazırlanması (High-K+ Çözeltisi)
- 10 ml damıtılmış su ile temiz bir beher buzun içine yerleştirin. Sürekli karıştırırken şunu ekleyin: K + -glukonat, 90.68 mg fosfokreatin di Tris tuzu, 47.66 mg HEPES, 1.5 mg EGTA, 40.58 mg mg2 + -ATP ve 4 mg Na + 2-GTP.
- KOH ile pH'ı 7,3'e ayarlayın (damıtılmış suda 100 mM). 20 mL'lik son hacme ulaşmak için damıtılmış su ekleyin. Gerekirse, sakaroz ile ozmolariteyi (damıtılmış suda 100 mM) 280 - 290 mOsm olacak şekilde ayarlayın. Seyreltmeden sonra, her bir bileşiğin nihai konsantrasyonu 124 mM K+-glukonat, 10 mM fosfokreatin di Tris tuzu, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 4 mM Mg2 + -ATP ve 0.3 mM Na + 2-GTP'dir.
- Hücre içi solüsyonları 1 ml'lik tüplerde alikotlayın ve -20 °C'de dondurun. Günde bir alikot kullanın ve deneyler sırasında 4 ° C'de tutun.
- Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kayıtları
- Dilimleri bir daldırma odasına yerleştirin ve bunları (1.5 ml / dak) oksijenli (%95 O2 -% 5 CO2) aCSF ile perfüze edin aşağıdaki reseptör antagonistlerini içerir: seçici NMDA reseptör antagonisti 2-amino-5-fosfonovalerik asit (APV, 40 μM), rekabetçi AMPA / Kainat glutamat reseptör antagonisti 6-siyano-7-nitrokinoksalin-2,3-dion (CNQX, 10μM), glisin reseptör antagonisti striknin (STR, 10 μM), spesifik GABAA reseptör antagonisti gabazin (GBZ, 10 μM) ve sodyum kanal blokeri tetrodotoksin (TTX, 3μM)
Kayıt yama pipetlerini (Direnç 2-7 MΩ; 1,0 mm dış çapa ve 0,6 mm iç çapa sahip normal, ticari olarak temin edilebilen kalın duvarlı borosilikat cam kılcal damarlardan yapılmıştır) hücre içi yüksek-K + çözeltisi ile doldurun ve piyasada bulunan yama pipeti dolgu maddelerini bir çözelti filtreli kullanın. Pipeti amplifikatörün tutucusuna yerleştirin. Üç bir vanaya bağlı bir silikon tüp kullanarak pipet tutucuya bağlı 1 ml'lik bir şırınga kullanarak küçük bir pozitif basınç uygulayın. Pipet tutucunun arkasını bir yama kelepçesine bağlayın .
- Kayıt pipetini, yakın kızılötesi diferansiyel girişim kontrast optikleriyle birleştirilmiş 4X objektif kullanarak PPN çekirdeğinin yakınında mekanik bir mikromanipülatör kullanarak hareket ettirin.
not: PPN çekirdeği, superior serebellar pedinkülün dorsalinde dilimler halinde gözlenebilir (SCP; kalın bir akson demeti olarak gözlemlenebilir). Kayıt pipetleri, pedinkülün arka ucunun hemen dorsalinde bulunan PPN pars compacta'ya yerleştirildi.
- 40X suya daldırmalı lens kullanılarak görselleştirilirken kayıt pipetini bir PPN nöronu ile temas ettirin ve hücre ile bir sızdırmazlık oluşturmak için hızla negatif emme uygulayın.
- Üreticinin protokolünü kullanarak negatif emme sırasında pipet direncini izlemek için voltaj kelepçesi conta yazılımını kullanın.
- Negatif emiş yavaşça arttığında ve pipetin ucundaki yama kelepçesi monitörü tarafından okunan direnç değerleri 80 - 100 MOhm'ye ulaştığında, tutma potansiyelini hızla -50 mV'a değiştirin ve negatif basıncı serbest bırakın. Nöronun zarını parçalayana ve tüm hücre konfigürasyonunda elektriksel erişim sağlanana kadar sürekli olarak negatif emme uygulamaya başlayın.
- Voltaj-kelepçe conta yazılımı tarafından ölçülen erişim direnci değerleri 10 MOhm veya daha yüksekse, daha küçük miktarlarda negatif emiş uygulamaya devam edin.
- Kapasitansı (yani, hücrenin zarını yırttıktan sonra gözlenen yavaş ve hızlı geçici akımlar) ve voltaj kelepçesi modunda seri direnci telafi edin. Kayıt modunu akım kelepçesine getirin ve köprü değerlerini hızlı bir şekilde telafi edin (örneğin, amplifikatör düğmesini hareket ettirin veya bilgisayarın faresini kullanarak otomatik telafi menüsüne tıklayın).
- Üreticinin protokolü kullanılarak kaydedilen PPN nöronunun dinlenme membran potansiyelini sürekli olarak izleyin. Dinlenme membranı potansiyeli depolarize veya hiperpolarize değerlere doğru kayarsa, optimum -50 mV nihai değeri korumak için küçük miktarlarda doğru akım (100 pA'ya kadar) kullanın.
not: Yalnızca -48 mV veya daha fazla hiperpolarize (yani RMP < -48 mV) stabil bir dinlenme membranı potansiyeline (RMP) sahip PPN nöronlarını tutun.
