$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. İki bipolar elektrotlu kulaklık yapımı (Şekil 1)
- 3,5 cm paslanmaz politetrafloroetilen kaplı paslanmaz çelik tel kesin.
- Her iki ucundan telden yaklaşık 1 mm yalıtım katını sıyırın. Çok fazla tel sıyrılmasına gerek yok.
- Pimin alt kısmı daha uzun bir yarık aşağı bakacak şekilde bir mengene tutucusuna iki pim yerleştirin.
- Telin soyulmuş uçlarına ve pimlerin üst kısımlarına akı uygulayın.
- Telin soyulmuş kısmını, kaplamaya yetecek kadar lehimle kalalaylayın.
- Yanlara taşmadan pimin üst kısmına minimum miktarda lehim ekleyin.
- Telin soyulmuş uçlarının bir ucunu, lehim erirken izin verdiği kadar derine pime yerleştirin.
not: Telin çıkabileceği bir yan delik vardır - telin pimden çıkmasına izin vermeyin. Soyulmuş telin tamamı pimin içinde kalmalıdır.
- İkinci pim için 1.6-1.7 adımlarını, şimdi telin diğer soyulmuş uçlarıyla birlikte tekrarlayın.
- Pimlerin sertleşmesi için 30 saniye bekletin, mengeneden çıkarın ve ardından tel ile pimler arasındaki bağlantının güçlü olduğundan ve tutulduğundan emin olmak için üzerlerinden çekin.
- Pimleri soğuk suyla durulayın ve ardından kurulayın.
- Bir ohmmetre kullanarak pim 1 ve pim 2 arasındaki iletkenliği doğrulayın.
- Telin uçlarındaki pimleri bir araya getirin; paralel ve yakın tutun. Telin ortasına bir kanama durdurucu sıkıştırın. Ardından, kanama durdurucuyu döndürün, böylece tel kendi etrafında oldukça sıkı bir şekilde bükülür. Kanama durdurucuyu çıkarın.
- Pimlerin 2 mm altındaki bükülmüş telin üzerine bir forseps sıkıştırın ve teli 90°'de bükün.
- Aynı teli tekrar forseps üzerinden 90° geriye doğru itin ve ilkinden 1 mm daha bükülme oluşturun.
- Bükülmüş teli küçük keskin makasla dirseğin altında 45° açıyla 3,5 mm olacak şekilde kesin.
- Her kulaklık için bu bipolar (çift pimli bükümlü) elektrotlardan iki tane hazırlayın (isteğe bağlı, ikincisi ilkinde elektrik sorunları olması durumunda yedeklenir).
- Her iki ucunda lehimlenmiş pimler bulunan bir teli ikiye bölerek tek bir referans elektrot hazırlayın (adım 1.1-1.17, Şekil 1A).
- Teli 7 mm'de kesin.
- Ucu ucun 1 mm altında bükün.
- Daha sonra telin bükülmüş 1 mm'lik ucunu forseps ile kapatın ve küçük bir halka (1 mm çapında) oluşturmak için teli forsepslerin etrafında sıkıca döndürün.
- Tel ucunun tekrar dışa bakmasını sağlamak için halkayı telin düz kısmına dik olarak bükün.
- İki bipolar elektrotu ve tek referans elektrodu, bipolar elektrotlar aralarında 6 mm mesafe olacak şekilde yan yana olacak ve referans elektrot orta dış deliğe yerleştirilecek şekilde altı pimli kaide içine monte edin (Şekil 1B).
not: Alternatif bir yöntem, elektrotları implante etmek, yerine yapıştırmak ve ardından pimlerini kaideye yerleştirmektir.
2. Stereotaksik elektrot implantasyonu
- Ameliyattan önce otoklavlama yaparak tüm cerrahi aletleri ve altı pimli elektrot tertibatını sterilize edin. Ameliyat sırasında steril bir cerrahi alan muhafaza edilmeli ve steril cerrahi eldiven kullanılmalıdır. Cerrahi alan dışında hayvanı örtmek için steril örtüler (örneğin, Press n' Seal) önerilir.
- Sütten kesmeden 4 hafta sonra ameliyatlar için 8 haftalık VGAT-Cre fareleri (veziküler GABA taşıyıcı [VGAT] geninin kontrolü altında Cre rekombinaz eksprese eden, yaşa uygun, hem erkek hem de dişi) kullanın. Ameliyat sonrası kilo kaybının ölçülmesine izin vermek için ameliyattan önce hayvanın ağırlığını kaydedin.
- Sertifikalı bir izofluran buharlaştırıcı veya hassas bir şırınga pompası, entegre dijital buharlaştırıcı ve geri beslemeli ısı yastığı ile donatılmış düşük akışlı bir anestezi sistemi kullanın.
not: Düşük akışlı sistemler, hayvanın büyüklüğüne orantılı düşük akış hızlarında anesteziyi bir indüksiyon odasına veya stereotaksik çerçeve üzerindeki bir burun konisi aracılığıyla verebilir (70 mL / dak, havadaki izofluran konsantrasyonu indüksiyon için% 4 ve% 2'dir. cerrahi için). Daha az anestezi kullanmak sadece ameliyatlar sırasında hayvana fayda sağlamakla kalmaz, aynı zamanda laboratuvar personelinin izoflurana maruz kalma riskini de azaltır.
- Anestezi uygulanmış hayvanı, ameliyat sırasında sıcak tutmak için 37 °C'ye ısıtılmış ısıtılmış bir ped üzerine yerleştirin. Geri besleme kontrollü bir sıcaklık sistemi kullanıyorsanız, ameliyat sırasında sıcaklığın izlenmesi için hafifçe yağlanmış sıcaklık probunu hayvanın rektumuna yerleştirin.
- Kulak çubuklarını kulaklara ve ön üst dişleri kesici uca nazikçe yerleştirerek hayvanı stereotaksik çerçeveye monte edin. Uygun anestezi uygulaması için burun konisini burnun üzerine yerleştirin. Başın düz ve ortalanmış olduğundan ve hafifçe incelendiğinde hareket ettirilemeyeceğinden emin olun.
- Hidrasyon için deri altına 0.5 mL normosol enjekte edin.
- Kornea kurumasını önlemek için oküler kayganlaştırıcı uygulayın.
- Arka ayak parmağını sıkıştırdıktan sonra geri çekilme refleksinin yokluğunda anestezi derinliğini izleyin ve ardından ameliyat sırasında izofluranı %1.5-2.0'a düşürün.
- Makas (tıraş) veya tüy dökücü krem kullanarak veya toplayarak cerrahi alandaki ve çevresindeki tüyleri alın ve cildi iyot ve etanolün dönüşümlü olarak üç döngüsüyle dezenfekte edin. Saçların cerrahi bölgeden uzaklaştırılması, yalnızca o bölgede anesteziyi sürdürmenin yolları varsa önerilir. Gerekirse, başın hemen etrafındaki alandaki tüyleri almak için alkole batırılmış pamuklu uçlu aplikatörler kullanın. Deri altına 0.05 mL lokal analjezik bupivakain (% 0.25) enjekte edin.
- Bir neşter kullanarak kafatası üzerinde bir kesi yapın ve ardından cildin bir kısmını keskin cerrahi makasla kesin ve kafatasını açığa çıkarın. Cildi bir kenara iterek, pamuklu bir bez kullanarak, kafatasını görüşü engelleyen tüm kaslardan ve alttaki dokulardan temizleyin.
not: Kazara kanamayı durdurmak için, kanama bölgesi durana kadar steril bir pamuklu çubukla üzerine baskı uygulayın.
- Kafatası dikişlerini ve hem bregma hem de lambda'yı görünür hale getirmek için steril pamuklu çubuklar kullanarak kafatasını hidrojen peroksit ile temizleyin.
- Kafatasını iyice kurulayın ve ardından aplikatörünü kullanarak bir damla kendiliğinden aşındıran diş yapıştırıcısı uygulayın. Kafatasına fırçalayın, 60 saniye bekleyin ve 40 saniye boyunca diş UV ışığı ile kürleyin. Parlak bir yüzey, yapıştırıcının kafatası ile etkili bir şekilde çapraz bağlandığını gösterir.
not: Bu adım, kulaklığın güvenli bir şekilde takılması için kritik öneme sahiptir.
- Hipokampal derinlik elektrotlarının implantasyonu için (yaklaşık 5.000 rpm) iki taraflı olarak iki çapak deliği açmak için 0,031" matkap ucu (0,79 mm) kullanın. Lambda'nın arkasındaki beyinciğin üzerinde referans elektrot için fazladan bir çapak deliği açın.
NOT: Delme sırasında, matkabı yavaşça indirmeye ve beyni delmekten kaçınmaya dikkat edin.
- Elektrotların koordinatları aşağıdaki gibidir (mm cinsinden bregmadan): 3 mm posterior, 3 mm lateral ve 3 mm derinlikte hipokampal elektrotlar; ve 6 mm posterior, 0 mm lateral ve 0 mm derinlikte serebellar referans elektrodu (subdural).
- Doğruluğu artırmak için, stereotaksik olarak monte edilmiş bir matkap kullanın, bregma'ya dokunurken stereotaksik manipülatör X / Y eksenini sıfırlayın - bu, koordinatlar için referans noktasıdır.
- Tüm elektrotları altı pimli kaide içine yerleştirerek bir kulaklık monte edin ve pimlerin kaide içine tamamen itildiğinden emin olun. Kaideyi stereotaksik bir çerçeve üzerindeki elektrot tutucusuna monte edin (Şekil 1B).
- Elektrotları karşılık gelen çapak deliklerinin üzerine hizalayın. Sağ ve sol hipokampusa bükülmüş bipolar paslanmaz çelik tel elektrotları ve referans elektrodu, kulaklığı yavaşça indirerek ve elektrotları çapak deliklerine yönlendirerek beyinciklere stereotaksik olarak implante edin.
- Hipokampal büküm elektrodu deliğin tam üzerinde olduğunda, Z eksenini sıfırlayın ve yavaşça -3.0 mm'ye indirin.
- Kafatası yüzeyini ve elektrotları diş çimentosu ile kaplayın ve kafatası yüzeyi ile kaidenin tabanı arasındaki boşluğu doldurun. Deri kenarları, altta yatan hiçbir doku açıkta kalmayacak şekilde diş çimentosuna bitişik olacaktır. Çimentonun kurumasını ve sertleşmesini bekleyin. Ardından elektrot tutucuyu stereotaksik koldan ayırın ve tutucuyu kaideden çıkarın.
- Analjezi için 0.1 mL ketoprofen (1 mg / mL, deri altından [SC]) ve hidrasyon için ikinci bir doz 0.5 mL normosol (SC) enjekte edin ve hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın.
- 37 °C'ye ısıtılmış izotermal bir pedi, bir kağıt havluyla kaplı boş bir vivaryum kafesinin içine yerleştirin. Tamamen uyandığında, hayvanı yatak takımları ve yumuşak yiyeceklerle temiz bir kafese koyun ve vivaryuma geri koyun. Hayvanlar, birbirlerinin kulaklıklarını çiğnemeyi önlemek için bu noktadan itibaren tek tek barındırılır. Kulaklıkların sıkışmasını önlemek için tel çubuk hazneleri kullanılmaz ve bunun yerine kafes üstlerinin alt tarafına su şişeleri bağlanır ve yatak takımlarında yemek bulunur.
- Ameliyattan sonra hayvanı 72 saat boyunca yumuşak yiyeceklerle besleyin ve kilo kaybını ve vücut kondisyon skorunu izleyin. Susuz kalmış hayvanlara, susuz kalmışlarsa (kilo kaybı, artmış cilt turgoru, batık gözler) deri altından 0.5 mL normosol uygulanabilir. Ketoprofen, ameliyatı takiben 2 gün boyunca günde bir kez deri altına verilebilir (yerel kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesi [IACUC] yönergelerine göre analjezi rejimini izleyin). Elektroensefalografi (EEG) kayıt sistemine aktarılmadan önce hayvanların 4-7 gün boyunca kafeslerinde tamamen iyileşmelerine izin verin.
