Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Çok Elektrotlu Dizi Kaydı için Deneysel Çözelti ve Ekipman Hazırlama
- Yapay beyin omurilik sıvısı hazırlayın (yapay beyin omurilik sıvısı [aCSF]; 124 mM NaCl, 4.4 mM KCl, 1 mM NaH2PO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3 ve 10 mM glikoz,% 95O2 ve% 5 CO2 ile köpürtülmüş).
- İki tür MEA probu kullanın: 6 x 10 düzlemsel MEA ve 8 x 8 MEA. Eski prob korteks, striatum ve talamusu içeren bölgeyi kapsar. İkinci prob sadece kortikal bölgeyi kapsar.
- 60 amplifikasyonda 0.1 Hz ile 3 kHz arasında ayarlanmış bant geçiren filtreye sahip 1,200 kanallı bir amplifikatör kullanın. 10 kHz örnekleme hızında veri alın.
- DCS için MEA haznesinin içine iki AgCl kaplı gümüş tel yerleştirin. İzole edilmiş bir stimülatör tarafından üretilen elektrik alanları üretmek için AgCl kaplı gümüş telleri kullanın.
- Talamik stimülasyon için bir tungsten elektrot (çap, 127 μm; uzunluk, 7.62 cm; 8 ° AC konik uç; direnç, 5 MΩ) yerleştirin ve referans elektrodu MEA odasına yerleştirin. Tungsten elektrotun akımlarını, bir darbe üreteci tarafından kontrol edilen izole bir stimülatör kullanarak iletin.
2. Beyin Dilimi Hazırlama
- 4-8 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanın. Hayvanları klimalı bir odada (21-23 °C; %50 nem; 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsü, ışıklar 08:00'de açık) yiyecek ve suya ücretsiz erişimi olan bir yerde barındırın.
- Adım 1.1'de hazırlanan aCSF'den 250 ml'lik bir alikot alın ve buz içeren bir behere yerleştirin. Aynı zamanda, %95O2 ve %5 CO2'den oluşan sürekli gaz sağlayın.
- ameliyat
- Hayvanı yaklaşık 3 dakika boyunca bir cam kutuda% 4 izofluran ile uyuşturun. Hayvan cerrahi bir anestezi derinliğine ulaştığında (ayak parmağının sıkışmasına yanıt verilmemesi ile gösterilir), kırılmış buzla doldurulmuş sığ bir tepsiye yerleştirin ve makas kullanarak kafayı çıkarın.
- Kafatasını açığa çıkarın ve kalan kası kesin. Daha sonra, rongeurs kullanarak, kafatasının dorsal yüzeyini beyinden soyun. Rongeurs kullanarak kafatasının kenarlarını kesin. Tüm cerrahi aletleri% 75 etanol çözeltisi ile sterilize edin.
- Bir spatula kullanarak, beynin ventral yüzeyi boyunca koku soğancıklarını ve sinir bağlantılarını kesin ve beyni çıkarın. Dekapitasyondan sonra, beyni hızlı bir şekilde buz gibi soğuk oksijenli aCSF ile doldurulmuş bir behere aktarın.
- MT-ACC Beyin Dilimi
Hazırlanması
not: MT'den ACC'ye giden yolu içeren dilimler hazırlayın.
- Subkortikal anatomiyi görüntülemek için beyin bloğunu her yarım kürede orta çizginin 2.0 mm lateralinde iki sagital kesi ile elle kesin. Ardından iki açılı kesim yapın. Striatumdaki görünür lif yoluna paralel olarak ilk çapraz kesimi yapın.
- Beyincik ve görsel korteks arasındaki bağlantıdan, ventral ve talamosinkülat yoluna paralel olan ön komissür ve optik yol arasındaki orta noktaya kadar ikinci çapraz kesimi yapın.
- Beyin bloğunu siyanoakrilat yapıştırıcı ile köşeli bir plakaya (~ 120 °) takın ve yolun dönüş noktasının hemen üzerinde bir kesim yapın. Plakayı açın, düzleştirin ve bir vibratomun hazne aşamasına yapıştırın.
- Medial talamus-ACC beyin dilimleri (500 μm kalınlığında) yapın ve ardından bunları buz gibi soğuk oksijenli aCSF'ye batırın. Dilimleri kayıt odasına aktarın ve 1 saat boyunca oksijenli aCSF ile sürekli perfüzyon (12 ml / dak) altında 32 ° C'de tutun.
3. Çok Elektrotlu Dizi Kaydı için Perfüzyon Odasının Hazırlanması
- Perfüzyon Odasının Hazırlanması
- Çok kanallı bir sisteme bir MEA probu yerleştirin ve probu peristaltik bir pompaya bağlamak için iki ayrı polietilen tüp kullanın. aCSF'yi MEA odasına yönlendirmek için bir tüp ve aCSF'yi hazneden çıkarmak için diğer tüpü kullanın. Son olarak, preparatı ılık (29-30 ° C) oksijenli aCSF (8 ml / dak) ile sürekli olarak perfüze edin.
- Beyin dilimini MEA'ya aktarın. Islak bir pamuklu çubuk kullanarak beyin dilimini MEA üzerinde tutun. ACC'nin elektrotların üzerine yönlendirildiğinden emin olmak için beyin dilimini dikkatlice hareket ettirin.
- Beyin dilimine basmak için dilim ankraj kitleri ve basılı tutmalar kullanın. Bu adım, dilim ve elektrotlar arasında iyi bir elektrik bağlantısı sağlar.
4. DCS ile Elektrik Alanlarının Üretilmesi
Not: Elektrik alan oryantasyonunun tanımı, ACC'deki aksodendritik eksenin yönüne dayanıyordu. Dendrit ve soma kompartmanlarının oryantasyonları Golgi boyaması kullanılarak doğrulandı.
- AgCl elektrodunu (anot olarak tanımlanır) ACC'nin proksimaline yerleştirin ve diğer elektrodu (katot olarak tanımlanır) ACC'nin distaline yerleştirin. MEA tarafından iki alan oryantasyonu (ACC aksodendritik liflerine paralel ve dik) tarafından üretilen alan kuvvetini kaydedin ve bir stimülatör kullanarak elektrik alanlarının akımlarını iletin.
- AgCl elektrotlarının mesafesini (yaklaşık 1.5-2 cm) sabitleyin ve DCS'yi 0.5 ile 2 mA arasında yapmak için stimülatörün akım gücünü ayarlayın.
5. Elektriksel Olarak İndüklenen Kortikal Sinaptik Tepkiler
Not: Programlanabilir bir elektriksel uyaran üretecinin dikdörtgen bifazik akım darbeleri ürettiği MT'de elektriksel stimülasyon ile ACC'de sinaptik tepkileri indükleyin.
- Yukarıdaki Bölüm 3'ü tekrarlayın.
- MT'ye bir tungsten elektrot yerleştirin ve stimülatörden bipolar tungsten elektrotlar aracılığıyla dilimlerin talamik bölgesine darbeler iletin.
- Bir ACC yanıtı ortaya çıkaran eşiği belirlemek için çeşitli akım yoğunluklarını kullanın. Burada, ±150 μA'lık bir yoğunluk ve 200 μsn'lik bir süre kullanın, bu da çoğu dilimde ACC'de %80'lik bir maksimum yanıt ortaya çıkardı.
- Optimum yanıt profillerini elde etmek için tungsten elektrodu MT-ACC dilimindeki talamosinkülat yolu boyunca (MT'den korpus kallozuma) hareket ettirin.
- 10-20 ACC yanıtı taraması yapın ve MT stimülasyonu tarafından uyarılan tüm ACC'nin otomatik olarak ortalamasını almak için yazılımı kullanın. Sonuç, MT-ACC yolağı ile MT stimülasyonundan indüklenen ACC'deki sinaptik yanıtlardır.
6. Elektrikle İndüklenen Nöbet Benzeri Aktivite
Not: Nöbet benzeri aktivite, 4-aminopiridin (4-AP; 250 μM) ve bikükülin (5 μM) uygulamasıyla indüklenmiştir. Önceki zaman kontrol çalışmaları, ilaç uygulamasından 2-3 saat sonra maksimum ve stabil yanıtların ortaya çıktığını göstermiştir.
- Yukarıdaki Bölüm 5'i tekrarlayın.
- Perfüzyon çözeltisine ilaçlar ekleyin. 4-AP (250 μM) ve bikükülin (5 μM) kullanın. İlaçları homojen bir şekilde karıştırın ve 2-3 saat perfüzyona devam edin.
- Nöbet benzeri aktiviteyi kolaylaştırmak için, perfüzyon pompasını nispeten hızlı bir perfüzyon hızında (8 ml / dak) tutun, bu da bir pH gradyanının birikmesini önlemeye yardımcı olabilir.
- MT'ye bir tungsten elektrot yerleştirin ve ACC yanıt profillerini elde etmek için elektrik stimülasyonu (150 μA, 200 μsn süre) verin.
- 10-20 tarama yapın ve yanıtların ortalamasını alın.
- İlaçları yıkamak için perfüzyon solüsyonunu taze aCSF ile değiştirin. Adım 6.5'i tekrarlayın.
7. DCS'nin Uyarılmış Kortikal Tepkiler Üzerindeki Etkisinin Test Edilmesi
- Bölüm 3 ve 4'ü tekrarlayın. MEA odasının içine yerleştirilen iki paralel AgCl kaplı gümüş tel arasında akım geçirerek tek tip elektrik alanlarının üretildiğinden emin olun. Herhangi bir sorun yoksa, DCS 0,5 ile 2 mA arasında kalır.
- DCS'yi kapatın ve talamusu uyarmak için bir tungsten elektrot yerleştirin (±150 μA, 200 μsn süre). ACC'de maksimum sinaptik yanıtlar elde etmek için 10-20 tarama yapın ve yanıtların ortalamasını alın.
- DCS'yi (2 mV/mm DCS gücü) ve talamik stimülasyonu (350 μA, 200 μsn süre) aynı anda açın. DCS sırasında talamik stimülasyonla uyarılmış ACC yanıtının genlik değişikliklerini değerlendirin.
- DCS'yi kapatın ve perfüzyon çözeltisine 4-AP (250 μM) ve bikükülin (5 μM) ekleyin. Ardından 2-3 saat bekleyin. İlaçlar beyin dilimini etkilediğinde, dilim kortikal nöbet yanıtları üretir.
- 10-20 ACC yanıtı taraması yapın ve ardından elektriksel uyarılmış kortikal nöbet yanıtlarının genliğini ve süresini ölçün.
- Adım 7.5'ten sonra, DCS'yi (2 mV/mm DCS gücü) ve talamik stimülasyonu (150 μA, 200 süre μsn) aynı anda açın. DCS uygulaması sırasında uyarılmış kortikal nöbet yanıtlarının amplitüdü ve süresindeki değişiklikleri değerlendirin.
- İlaçları yıkamak için perfüzyon solüsyonunu taze aCSF ile değiştirin ve 7.2 ve 7.3 adımlarını tekrarlayın.
- Tüm kayıt verilerini toplayın ve verileri farklı deney koşullarına göre gruplandırın. Farklı deneysel koşullar altında kortikal nöbet yanıtlarının genliğini ve süresini değerlendirin.