Nöronal Hücrelerden Protein Ekstraksiyonu

Özet

Kaynak: Shani, T., et al. Motor Nöron Benzeri NSC-34 Hücreleri İçinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşımayı Ölçmek için Deney. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu protokol, nöronal kanser hücrelerinden proteinlerin ekstraksiyonunu ana hatlarıyla belirtir. Hücreler bir tampon ile yıkanır ve enzimatik ve mekanik bozulma yoluyla parçalanır. Ekstrakte edilen protein açısından zengin süpernatant, santrifüjlemeden sonra toplanır.

Protokol

1. Hücre Hattı Hazırlığı

1. Sıvı bir nitrojen kabında saklanan yaklaşık 1.000.000 fare nöroblastom omurilik hücresini (NSC-34 hücreleri) çözün. Hücreler tamamen çözülene kadar 37 °C'lik bir su inkübatörü kullanın.
2. Taze, ılık ortam ekleyin (% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 L-glutamin ve% 1 pen-strep antibiyotik içeren DMEM ortamı).
3. Çözülmüş hücreleri (SL16R) 500 x g'da 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve bir hücre peleti oluşturun. Ortamı atın ve hücre yeniden süspansiyonu için 1 mL yeni ortam ekleyin.
4. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 15 mL'lik bir şişeye yerleştirin ve fazladan 5 mL ortam ekleyin. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO₂ içeren steril bir inkübatörde inkübe edin.
5. Paralel olarak, 8 kaplamasız lamel (kapak camı: 12 mm, 0,13-0,17 mm kalınlığında) 60 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin ve %70 etanol kullanarak ve kuruyana kadar 30 dakika UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin. Her tabağa orta ekleyin ve kalan etanolü yıkamak için atın.
6. Yapışık hücrelerin ayrışmasına izin vermek için yaklaşık% 90 birleşmeye (şişe başına yaklaşık 6 milyon hücre) ulaştıktan sonra hücrelere tripsin tamponu (1 L Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisinde 2,5 g tripsin ve 0,2 g EDTA) ekleyin.
   NOT: NSC-34 hücreleri hassastır ve ortamı kullanarak ayrışmadan önce sadece 15 s tripsin tampon inkübasyonu ve tripsin içermeyen 1 dakika ek inkübasyon gerektirir.
7. Hücreleri, tabak başına yaklaşık 350.000 olmak üzere 3 mL orta boy ile lamelleri içeren 60 mm'lik kültür kaplarının üzerine yerleştirin. Lamellere hücre bağlanmasına izin vermek için 24 saat inkübatörde bırakın.

2. Protein İfade Doğrulaması

1. Her deney grubundan kalan hücreleri (yukarıdaki deneyde kullanılmayan) içeren 60 mm'lik kültür kaplarını buz üzerine yerleştirin.
2. Ortamı atın ve kalan ortamı seyreltmek ve yıkamak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
3. Hücreleri PBS,% 0.5 Triton ve proteaz inhibitörü kokteyl tableti (PI) içeren 200-400 μL lizis tamponu ile tedavi edin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak kazıyın.
4. Hücreleri bir mikrosantrifüj tüpünde lizis tamponunda toplayın ve buz altında 1 dakika boyunca 4.000 rpm'de bir homojenizatör ile homojenize edin.
5. Homojenize hücreleri 10 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın, bir Bradford testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
6. 30 ila 70 μg arasında toplam protein (proteine bağlı olarak) toplayın ve bir immünoblot testi kullanarak protein ekspresyonunu test etmek için bir SDS-PAGE jeline yükleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fare Motor Nöron Benzeri Hibrit Hücre Hattı (NSC-34)	tebu-biyografi	CLU140-A
DMEM 4.5g/L L-glikoz	Biyolojik Endüstriler	01-055-1A
FBS Avrupa Sınıfı	Biyolojik Endüstriler	04-007-1A
SL 16R Santrifüj	Termo Bilimsel	75004030
Thermo Forma Serisi ii Su Ceketli CO2 İnkübatörü	Termo Bilimsel	3111
Kapak camı 12mm çap.kalınlık 0.13-0.17mm	Bar Naor Ltd
Axiovert 100 ters mikroskop	Zeiss
Leptomisin B	Sigma	L2913
Pbs	Biyolojik Endüstriler	02-023-1A
Homojenizatör motoru/kontrol/mandren/90 derece kelepçe	Glas-Col	099C K5424CE
MicroCL 17R Santrifüj, Soğutmalı	Termo Bilimsel	75002455