>1. Astrositlerde Bağıl Hücre Yüzeyi Protein Ekspresyonunun Biyotinilasyon ile Belirlenmesi
NOT: Burada, bu biyotinilasyon tekniğinin, hücre dışı matris molekülü lamininin, su geçirgen kanal aquaporin-4'ün (AQP4) hücre yüzeyi lokalizasyonu üzerindeki etkilerinin incelenmesine uygulanmasını gösteriyoruz. Bu test için gerekli olan özel malzemeler arasında sülfo-NHS-LC-biyotin (sülfosüksinimidil 6- (biyotinamido) Hekzanoat) ve streptavidin-agaroz reçinesi bulunur (bkz.
- Yöntemi kullanarak, testten yaklaşık 2 hafta önce kortikal astrosit kültürlerini hazırlayın ve bunları 75cm2 havalandırmalı kültür şişelerinde büyütün. Astrositler% 80 - 90 birleştiğinde,% 0.05 tripsin kullanarak kültür yüzeyinden ayırın ve ardından 1: 3'ü geçirin.
- Tahlilden 48 saat önce, hücreler tekrar% 80 - 90 birleştiğinde, astrositleri 1: 3'ü (kültür formatındaki değişikliği hesaba katarak) 60 mm'lik hücre kültürü kaplarına geçirin, böylece deneyin yapılacağı gün% >70 birleşmiş olurlar. Hücrelerin bulaşıklar arasında eşit olarak dağıldığından emin olun.
- Testten 16 saat önce, laminini 24 nM'lik bir nihai konsantrasyona kadar kültür ortamına pipetleyin ve 37 ° C'de inkübe edin.
- Tahlilden hemen önce aşağıdakileri hazırlayın ve ardından buza koyun veya soğutun: CM-PBS (100 mg / L MgCl2∙6H2O ve 100 mg / L CaCl2 1X fosfat tamponlu salin [PBS], pH 7.4), biyotin tamponu (CM-PBS'de 0.5 mg / mL sülfo-NHS-LC-biyotin), söndürme tamponu (CM-PBS'de 50 mM NH4Cl), lizis tamponu (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM glisin, 150 mM NaCl ve 5 mM etilendiamintetraasetik asit [EDTA], %1 triton X-100, 1X proteaz inhibitör kokteyli), 3X yükleme tamponu (150 mM Tris, pH 6.8, %6 sodyum dodesil sülfat [SDS], %30 gliserol, 300 mM ditiyotreitol [DTT] ve %0.01 bromofenol mavisi) ve yıkama tamponu (10 mM Tris (pH 7.4), 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, %1 Triton X-100, 1X proteaz inhibitör kokteyli).
- Astrosit kültürlerini tutan bulaşıkları inkübatörden çıkarın ve ortamı atın.
- Hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın ve bulaşıkları kırılmış buzun üzerine yerleştirin.
- Her bir oyuğa 2 mL biyotin tamponu pipetleyin ve tam kapsama sağlamak için bulaşıkları birkaç kez hafifçe ileri geri eğin. 30 dakika buz üzerinde bırakın.
- Bir aspiratör kullanarak biyotin tamponunu çıkarın ve 4 mL söndürme tamponu ile değiştirin. 10 dakika buz üzerinde bırakın.
- Söndürme tamponunu aspire edin ve aynı hacimde eşdeğer bir hacimle değiştirin. Yine 10 dakika buz üzerinde bırakın.
- Söndürme tamponunu atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın.
- Bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri 1 mL soğutulmuş CM-PBS'ye kazıyın ve süspansiyonu mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 3 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri. Süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
- Numuneleri 30 dakika buz üzerinde bırakın, her 5 dakikada bir girdap yapın veya 4 °C'de uçtan uca bir döndürücüye yerleştirin.
- Deterjanda çözünmeyen herhangi bir malzemeyi peletlemek için lizatı 14.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Bu lizattan 50 μL tasarruf edin ve üzerine yükleme tamponu ekleyin. Daha sonra kuru bir banyoda 95 °C'de ısıtarak denatüre edin; Bu, hem biyotinile hücre yüzeyi proteinlerini hem de biyotinile edilmemiş sitozolik proteinleri içeren "giriş" fraksiyonudur.
- Bir çift keskin makas kullanarak ucundan yaklaşık 0,5 cm malzeme keserek pipet ucunun açıklığını genişletin. Bu pipet ucunu kullanarak, 75 μL streptavidin-agaroz boncuklarını (normalde 4 ° C'de saklanır) lizata aktarın ve çalkalayıcı / külbütör üzerinde 3 ° C'de 4 ° C'de inkübe edin.
- Streptavidin-agaroz sıklıkla hacimce %50 boncuk içeren, antimikrobiyal bir çözelti içinde süspanse edilmiş bir bulamaç olarak satıldığından, boncukların eşit şekilde süspanse edildiğinden emin olmak için bulamacı tritüre edin ve ardından her numuneye 150 μL süspansiyon pipetleyin.
- 4 ° C'de 30 saniye boyunca 1500 x g'da santrifüjleme ile pelet streptavidin-agaroz boncukları.
- Süpernatanı 50 μL tasarruf edin (yükleme tamponu ekleyin ve bir su banyosunda veya ısıtma bloğunda 95 ° C'de denatüre edin); bu, "hücre içi" fraksiyonu temsil eder ve esas olarak biyotinillenmemiş sitozolik proteinlerden oluşur.
- Peletlenmiş boncukları 1 mL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve bunu 4 °C'de 3 dakika boyunca sallayın. Pelet boncukları (adım 1.16'daki gibi) ve süpernatanı atın. Biyotinile edilmemiş sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmek için bu işlemi 4 kez tekrarlayın.
- Boncukları santrifüjleme ile peletleyin (4 ° C'de 30 saniye boyunca 1500 x g) ve üstteki yıkama tamponunu atın. 50 μL 1X yükleme tamponu ekleyin (lizis tamponu kullanılarak seyreltilmiş). Biyotin ve streptavidini 95 ° C'de denatüre ederek boncuklardan serbest bırakın; Bu fraksiyon sadece biyotinile hücre yüzeyi proteinleri içermelidir ("hücre yüzeyi" fraksiyonu).
- Giriş, hücre yüzeyi ve hücre içi fraksiyonları SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi) ile ayırın ve western blotting ile analiz edin.
not: Deneylerimizde %4 - 20 prekast gradyan jel kullanırken,% 4'lük bir istifleme tabakasına (her biri% 0.1 SDS içeren)% 12 - 14'lük bir ayırma jeli bu çalışmada ilgilenilen proteinler için yeterli olmalıdır. Uygun boyut aralığına sahip bir moleküler ağırlık standardı da kullanılmalıdır. Biyotinile proteinlerin görünür moleküler kütlelerinde bazen gözlemlenebilir bir yükselme olabileceğini unutmayın.