$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Astrositlerdeki Hücre Yüzeyi Proteinlerinin Biyotinilasyon ile İçselleşme Hızının Belirlenmesi
NOT: Aşağıda, astrositlerde AQP4'ün endositozunu izlemek için bu örnekte kullanılan tipik bir nabız kovalama biyotinilasyon deneyini açıklıyoruz. Gerekli özel malzemeler arasında sülfo-NHS-SS-biotin, streptavidin-agaroz reçinesi, indirgenmiş glutatyon ve iyodoasetamid bulunur (bkz.
- Önceki bölümde belirtilen yöntemleri kullanarak 60 mm'lik tabaklarda fare kortikal astrositlerinin kültürlerini hazırlayın. Tahlil gününde hücrelerin yaklaşık% 70 oranında birleştiğinden ve her kabın eşdeğer sayıda hücre içerdiğinden emin olun.
- Tahlilden hemen önce, aşağıdakileri hazırlayın ve buzun üzerine koyun veya soğutun: CM-PBS veya Fosfat tamponlu salin (100 mg / L MgCl2∙6H2O ve 100 mg / L CaCl2, 1X PBS'de, pH 7.4), biyotin tamponu (CM-PBS'de 0.5 mg / mL sülfo-NHS-SS-biyotin), indirgeyici tampon (50 mM azaltılmış glutatyon, 75 mM NaCl ve 75 mM NaOH), söndürme tamponu (50 mM iyodoasetamid, %1 BSA, CM-PBS'de), lizis tamponu (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM glisin, 150 mM NaCl ve 5 mM EDTA veya Etilendiamintetraasetik asit, %1 triton X-100, 1X proteaz inhibitör kokteyli), 3X yükleme tamponu (150 mM Tris, pH 6.8, %6 SDS veya Sodyum dodesil sülfat, %30 gliserol, 300 mM DTT veya Dithiothreitol ve %0.01 bromofenol mavisi), ve yıkama tamponu (10 mM Tris, pH 7.4, 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, %1 triton X-100, 1X proteaz inhibitör kokteyli).
- Taze hücre kültürü ortamı hazırlayın (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı; veya% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş DMEM) ve 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- Astrosit kültürlerini inkübatörden çıkarın ve ortamı bir aspiratör kullanarak aspire edin.
- Hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın ve bulaşıkları kırılmış buzun üzerine yerleştirin.
- Her tabağa 3 mL biyotin tamponu pipetleyin, tamponun iyi dağıldığından emin olmak için tabakları birkaç kez ileri geri eğin ve 30 dakika buz üzerinde bırakın.
- Biyotin tamponunu aspire edin ve 5 mL ılık ortam ile değiştirin. Bir kültür kabını 37 °C'de 15 dakika ve ikinci bir kabı aynı sıcaklıkta 30 dakika inkübe edin. 0 dakikalık numune olarak 4 °C'de başka bir tabak bırakın.
- İnkübasyon süresinin sonunda, ortamı atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın. Hücrelerin üzerine 6 mL azaltıcı tampon pipetleyin ve 15 dakika buz üzerinde bırakın.
- İndirgeyici tamponu çıkarın ve 6 mL taze indirgeyici tampon ile değiştirin. Karışımı 15 dakika daha buzun üzerine koyun.
- İndirgeyici çözeltiyi çıkarın ve 6 mL söndürme tamponu ile değiştirin. 15 dakika buz üzerinde bırakın.
- Söndürme adımını bir kez daha tekrarlayın.
- Söndürme tamponunu atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın.
- Bir hücre kaldırıcı kullanarak, hücreleri 1 mL soğutulmuş PBS'ye kazıyın ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 3 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri. Süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
- Bunu 30 dakika buz üzerinde bırakın ve her 5 dakikada bir girdap yapın. Alternatif olarak, numuneleri bu süre boyunca 4 ° C'de uçtan uca bir döndürücüye yerleştirin.
- Deterjanda çözünmeyen malzemeleri peletlemek için lizatı 14.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu lizattan 50 μL tasarruf edin, üzerine yükleme tamponu ekleyin ve kuru bir banyoda 95 ° C'de denatüre edin; Bu, hem biyotinile endositozlu proteinleri hem de biyotinile edilmemiş proteinleri içeren "giriş" fraksiyonudur.
- Kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, lizata 150 μL streptavidin-agaroz bulamacı ekleyin ve bir çalkalayıcı / külbütör üzerinde 4 ° C'de 3 saat inkübe edin.
- 4 ° C'de 30 saniye boyunca 1.500 x g'da santrifüjleme ile pelet streptavidin-agaroz boncukları.
- Boncukları 1 mL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve 4 °C'de 3 dakika boyunca sallayın. Pelet boncukları (adım 1.18'e göre) ve süpernatanı atın. Biyotinile edilmemiş sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmek için bu işlemi 4 kez tekrarlayın.
- 4 °C'de 30 saniye boyunca 1.500 x g'da santrifüjleme ile pelet boncukları ve üstteki yıkama tamponunu atın. 50 μL 1X yükleme tamponu ekleyin (lizis tamponu kullanılarak seyreltilmiş). 95 ° C'de denatüre ederek boncuklardan biyotin ve streptavidin salın; Bu fraksiyon sadece içselleştirilmiş hücre yüzeyi proteinlerini içermelidir ("endositozlanmış" fraksiyon).
- Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile giriş, hücre yüzeyi ve bağlanmamış fraksiyonları ayırın ve western blotting.
ile analiz edin
not: Deneylerimizde %4 - 20 prekast gradyan jel kullanırken,% 4'lük bir istifleme tabakasına (her biri% 0.1 SDS içeren)% 12 - 14'lük bir ayırma jeli bu çalışmada ilgilenilen proteinler için yeterli olmalıdır. Uygun boyut aralığına sahip bir moleküler ağırlık standardı da kullanılmalıdır. Biyotinile proteinlerin görünür moleküler kütlelerinde bazen gözlemlenebilir bir yükselme olabileceğini unutmayın.