$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Matrislerin Hazırlanması
- 4-8 silikon matrisi mikrodalgada veya sıcak bir plakada 5 dakika kaynatın ve laminer akış altında (çizgili tarafı yukarı) 1 saat tamamen kurumasını bekleyin.
not: Laminer akış altında aşağıdaki prosedürler gerçekleştirilmelidir.
- Matrislerin çizgili tarafındaki tozu temizlemek için basınçlı hava üfleyin veya şeffaf yapışkan bant kullanın. Plaka yüzeyine sıkıca yapışabilmesi için çizgili tarafı temiz tutun.
- Matrisleri parmağınızla bastırarak 6 cm'lik plastik tabakların üzerine dikkatlice yerleştirin (tabak başına bir matris; şerit tarafı aşağı). Matris ve çanak arasına hava kabarcıkları girmesini önleyin. Kültür kabının alt tarafındaki şeritlerin yerini işaretleyin.
- Matris bağlanmazsa, adım 1.2'den itibaren tekrarlayın.
2. Nöron Kültürü için Şerit Oluşturma ve Laminin Kaplama
- Fc etiketli proteini (10-50 μg/ml) ve floresan boya konjuge anti-insan Fc antikorunu (1 ila 3 oran: 30-150 μg/ml) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde karıştırarak floresan etiketli rekombinant protein (enjeksiyon için her biri 25 μl [adım 2.2] veya yerleştirme yöntemi için her biri 100 μl [adım 2.2.1]) hazırlayın. Ardından, karışımı RT'de 30 dakika inkübe edin.
- 22 G'lik bir şırınga kullanarak, önceki adımda (2.1) hazırlanan rekombinant proteinin 25 μl'sini matrisin yan tarafındaki küçük delikten (Şekil 1A, 1C ve 1E'deki oklar) enjekte edin.
- Alternatif olarak, 100 μl rekombinant proteini matrisin üst yarığına yerleştirin ve çözeltinin yaklaşık yarısını küçük delikten (Şekil 1A, 1C ve 1E'deki oklar) aspire edin, böylece rekombinant protein çizgili bölgelerde kalır.
- Çanağı bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Üst yarığa 300 μl PBS yerleştirin (Şekil 1B) ve bağlanmamış rekombinant proteinleri çıkarmak için matrisin yan tarafında bulunan küçük delikten (Şekil 1A, C ve E'deki oklar) aspire edin. PBS'yi tamamen aspire etmeyin, çünkü proteinler kurur. Bu adımı iki kez tekrarlayın. (Toplam 3 kez)
- Matrisi dikkatlice çıkarın ve hemen ~ 100 μl kontrol proteini (10-50 μg / ml; Fc) tüm çizgili alanı kaplamak ve alternatif bir kaplama oluşturmak için. Ardından, çanağı hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Bulaşık yüzeyini PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, PBS.
'de ~100 μl 20 μg/ml laminin ile kaplayın
not: Katılaşmayı önlemek için laminin buz üzerinde çözülmelidir.
- Çanağı hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Bulaşık yüzeyini PBS ile üç kez yıkayın ve kültür ortamı ekleyin. Kaplanmış kabı kültür ortamı ile kullanılana kadar 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
3. E15.5 Fare Embriyolarından Hipokampal Nöronların Kültürlenmesi
- Anneyi servikal çıkık yoluyla ötenazi yapın ve üç E15.5 embriyosunu izole edin.
- Cildi ve kafatasını başın orta hattından sagital olarak makasla kesin ve küçük bir kaşık kullanarak beyni çıkarın. Beyni, 3 ml Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren 60 mm'lik bir Petri kabına dikkatlice aktarın.
- Bir neşter kullanarak korteks, hipokampus ve striatum dahil olmak üzere hemisferleri kesin (Şekil 2A). Daha sonra, meninksleri dikkatlice çıkararak hipokampal bölgeyi inceleyin ve diseke edilen hipokampal dokuları buz üzerinde 2 ml HBSS solüsyonu içeren 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın (Şekil 2B-C). Tüpteki 3 embriyodan 6 hipokampi toplayın, bu da 8 tabakta nöronları kültürlemek için yeterlidir.
- HBSS çözeltisini tripsin / etilendiamin tetraasetik asit (tripsin / EDTA) çözeltisi (2 ml) ile değiştirin ve tüpü bir su banyosunda 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
not: Santrifüj olmadan HBSS'yi aspire edin ve tüpü eğerek HBSS çözeltisini boşaltmayın.
- 500 μl fetal sığır serumu (FBS) ekleyerek tripsin aktivitesini nötralize edin.
- Karışımı 100 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 2 ml kültür ortamı ile yıkayın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Dokuyu ayırmak için büyük bir delik (kesik uç) ile 1.000 μl'lik bir uç kullanarak hipokampusu bir kültür ortamında 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Normal (kesilmemiş) 1.000 μl'lik bir uca geçin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için ayrışmış dokuyu yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Tek hücreleri 80-100 μm'lik bir ağ hücre süzgecinden geçirerek ayırın.
- Filtrelenmiş tek hücreli süspansiyonu 150 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire ederek çıkarın ve peleti (nöronlar) 2 ml kültür ortamında yeniden süspanse edin.
- Yoğunluğu ve canlılığı belirlemek için tripan mavisi boyamalı bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, her bir şerit seti için 150 μl kültür ortamında 10.000 nöron plakalayın. Süspansiyon, tüm şerit bölgesini kaplayacak şekilde dikkatlice yerleştirilmelidir.
