Travmatik Beyin Hasarının Bir Fare Beynine Verilmesi

Özet

Kaynak: Zhong, J., et al. Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kranial Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Fotonlu Mikroskop Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, farelerde Travmatik Beyin Hasarı (TBI) oluşumunu göstermektedir. Kafatası açığa çıkarıldıktan sonra, TBI bölgesi işaretlenir. Fare daha sonra TBI cihazının altına yerleştirilir. Darbe, metal çubuğun kaldırılması ve kafatası ile temas halinde olan çarpma tertibatının üzerine serbestçe düşmesine izin verilmesiyle sağlanır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Tekrarlayan travmatik beyin hasarı (TBI) indüksiyonunun uygulanması

NOT: TBI parametreleri, TBI etkisinin bir kez iletildiği önceki raporlardan ayarlanmıştır. Buradaki protokol, toplam etki sayısını 10'a çıkarmak dışında aynı parametreyi uygular.

1. TBI ekipmanı
   1. Şekil 1B'de gösterildiği gibi, sağ taraftaki fare kafasına kapalı bir kafatası TBI (Şekil 1A) uygulamak için özel olarak oluşturulmuş taşınabilir bir cihaz kullanın.
2. Ameliyat öncesi hazırlık
   1. Normal makas, cerrahi kumpas, cerrahi yaylı makas, cerrahi forseps, sivrisinek forsepsleri, baş direği parçaları, gazlı bez ve pamuk uçlu aplikatörler dahil olmak üzere otoklav cerrahisi ekipmanı.
   2. Ameliyattan 2 saat önce farenin vücut ağırlığını tartın ve kaydedin. Kraniyal pencere implantasyonu sırasında beyin ödemini en aza indirmek için, bir insülin şırıngası kullanarak kuadriseps kasına 4.8 mg / kg [2 mg / mL, genellikle ~ 70 μl (iki bölgeye enjekte edilmesi gerekir)] dozunda deksametazon sodyum fosfat enjekte edin. Deksametazon enjeksiyonundan sonra, ancak TBI ameliyatına başlamadan önce, cam pencereleri daha sonra kullanmak üzere adım 2.1'de belirtildiği gibi hazırlayın.
   3. Cerrahi aşamayı ve TBI ekipmanını% 75 etanol kullanarak dezenfekte edin. Stereotaksik platformdaki ameliyat aşamasını kapsayacak şekilde tek kullanımlık steril cerrahi örtüyü genişletin. Hedef sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayarak ısıtma cihazını ve sıcaklık monitörünü açın.
   4. Oksijen tankı valfini açın ve oksijen akışını 1,5 L/dk'ya ayarlayın. Anestezi makinesini açın ve izofluran seviye değerini üç.
      olarak ayarlayın NOT: %100 saf oksijen, hayvanın TBI etkilerinden kurtulmasına yardımcı olabilir.
   5. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve tam anestezi elde etmek için 5 dakika kalmasına izin verin.
   6. Fare tamamen uyuşturulduktan sonra (yani, kuyruk kıstırma refleksinin yokluğuyla birleştiğinde, yaklaşık 2 saniyede bir döngüde yavaş ama sabit solunum hızları), fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve fare kafasını stereotaksik çerçeveye yerleştirin.
   7. Anestezi tüpü burun konisini farenin burnunun üzerine yerleştirin.
   8. Ameliyatın sonuna kadar 1 L / dk akış hızında% 100 saf oksijen ile karıştırılmış% 1.5 izofluran kullanarak anesteziyi koruyun. Nefes frekansını periyodik olarak kontrol edin ve uygun anesteziyi değerlendirmek için ameliyat boyunca en az 15 dakikada bir kuyruk veya ayak parmağını çimdikleyin. İstenilen anestezi derinliğini korumak için izofluran konsantrasyonunu uygun şekilde ayarlayın.
3. TBI ameliyatı
   1. Tek kullanımlık insülin şırıngaları kullanarak buprenorfin (deri altından 1 mg / kg) uygulayın ve farenin gözlerine oftalmik merhem sürün.
   2. Makasla 1 keserek ve ardından 1 dakika boyunca tüy dökücü bir madde uygulayarak başın üst kısmındaki tüyleri çıkarın.
      DİKKAT: Tüy dökücü ajan ürününü cildi tahriş edici olduğu için saç derisine 3 dakikadan fazla uygulamayın. Ayrıca, farenin gözlerine herhangi bir tüy dökücü madde sokmaktan kaçının.
   3. Gazlı bez ve pamuk uçlu aplikatörler uygulayarak kafa derisini temizleyin. Ardından, önce %75 etanol ve ardından betadin kullanarak cildi dezenfekte edin. Bunu üç kez tekrarlayın (yani, etanol ve ardından betadin), betadinin son uygulamasını ciltte bırakın.
   4. Farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için anestezik derinliği tekrar kontrol edin (yani, kuyruk kıstırma refleksinin yokluğuyla birleştiğinde, yaklaşık 2 saniyede bir döngüde yavaş ama sabit solunum hızları). Cildi cerrahi forseps 3 ile örtün ve gözlerden yaklaşık 3 mm geriden başlayarak 12-15 mm uzunluğunda orta hat kesisi yapın.
   5. Yaylı makas 2 kullanarak kafatasının sol ve sağ yarım küresindeki cildi eksize edin.
   6. Kafatası açığa çıktığında, steril pamuk uçlu bir aplikatörle hafifçe ovalayarak ve steril tuzlu su ile yıkayarak periosteuumu çıkarın.
   7. Önceki virüs enjeksiyon ameliyatı için yapılmış iki küçük delik dışında, sağlam olduğundan emin olmak için kafatasının durumunu görsel olarak inceleyin.
   8. Kafatası bölgesini kurutun ve TBI çarpma bölgesini aşağıdaki koordinatlarda işaretleyin: Bregma'nın 2,5 mm posterior ve sagital sütürden sağa doğru 2 mm lateral (Şekil 1B).
   9. Fareyi stereotaksik çerçeveden hızlı bir şekilde çıkarın ve kafayı TBI cihazının altındaki tampon yastığına yerleştirin.
   10. Çarpma tertibatı ucunu işaretli çarpma bölgesi ile hizalayın.
   11. Bağlı naylon ipi fare kafasının 15 cm yukarısına çekerek metal sütunu kaldırın ve ardından serbest bırakın, ağırlığın TBI bölgesindeki kafatası üst kısmı ile temas halinde olan dönüştürücü çubuğun üzerine serbestçe düşmesine izin verin. TBI etkisini iletirken fare kafasına dokunmayın.
   12. Fareyi ısıtma battaniyesinin üzerine getirin ve solunum durumunu izlerken sırt üstü yatırın.
   13. Fare sırtüstü pozisyondan yüzüstü pozisyona geçtiğinde, 1,5 L/dk akış hızında %100 saf oksijen ile karıştırılmış %3 izofluran ile ~5 dakika boyunca izofluran indüksiyon odasına yerleştirin.
   14. Fare tamamen sakinleştirildikten sonra (yani, kuyruk kıstırma refleksinin yokluğuyla birleştiğinde, yaklaşık 2 saniyede bir döngüde yavaş ama sabit solunum hızları), toplam 10 etki elde etmek için 1.3.9-1.3.14 adımlarını tekrarlayın.
       NOT: Çalışmamızda on TBI etkisinin düşük fare mortalitesi ile sağlam fenotipi indüklediği bulunmuştur (veriler henüz yayınlanmamıştır). Parametreler, darbe sayısını ve / veya ağırlığın serbest bırakıldığı yüksekliği artırarak veya azaltarak farklı bir beyin hasarı şiddeti elde etmek için ayarlanabilir. Tüm parametreler yerel IACUC tarafından onaylanmıştır.
   15. Kafatasını cerrahi mikroskop altında kontrol edin ve kafatası kırığı meydana geldiyse fareyi çalışma odasından çıkarın.
   16. Sahte cerrahi için, hayvanı çarpma tertibatının altına yerleştirmek de dahil olmak üzere, ancak TBI etkilerini iletmeden yukarıda açıklanan prosedürlerin aynısını izleyin.
   17. Fare, 10. TBI etkisini takiben sırtüstü pozisyondan yüzüstü pozisyona geçtikten sonra, ~ 5 dakika boyunca izofluran indüksiyon odasına yerleştirin. Ardından, aşağıda açıklanan kranial pencere implantasyon ameliyatı için fare kafasını stereotaksik çerçeveye yerleştirmek için 1.2.6-1.2.8 adımlarını izleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: TBI cihazı, TBI darbe alanı ve pencere hazırlığı için diyagramlar. (A) Ağırlık düşürme TBI cihazı için ekipman. 1: kaide, 2: braket, 3: ayarlanabilir kelepçe, 4: naylon ip, 5: ağırlık bırakma tüneli, 6: metal ağırlık sütunu (50 g), 7: çarpma tertibatı, 8: tampon yastığı. (B) Bregma'nın 2,5 mm arkasında ve sagital sütürden sağa doğru 2 mm lateral koordinatları ile virüs enjeksiyonu ve TBI etki...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ayarlanabilir Hassas Aplikatör Fırçaları	Parkell	S379 Serisi
BD insülin şırıngası	Bd	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16 inç x 31 G
Betadin	Purdue	NDC67618-151-17	% 7.5 povidon iyot dahil
Buprenorfin	PAR İlaç	NDC 42023-179-05
Etnik Ton	Balıkçı Bilimsel	04355223EA	%75
Isıtma aparatı	CWE (Türkçe)	TC-1000 Fare	Stereotaksik aletle donatılmıştır ve ameliyatı yaparken kullanılabilir
Isıtma battaniyesi	CVS eczane	E12107	Ekstra ısıtma cihazı ve ameliyat sonrası kullanılabilir
Kayganlaştırıcı oftalmik merhem	Resimli	NDC 46066-753-55
Keçeli kalem	Delasco Belediyesi	SMP-BK
Sivrisinek forseps	Carolina	Ürün #:625314	Paslanmaz Çelik, Kavisli, 5 inç
Tüy dökücü ajan	McKesson Şirketi	Yok	Nair Hair Aloe & Lanolin Tüy Dökücü Losyon
Normal makas 1	Avrupa İstatistik Kurumu (Eurostat	Eurostat ES5-300
Normal makas 2	Dünya Hassas Aletler	Hayır. 501759-G
tuzlu	Biyolojik dünya	L19102411PR
Yaylı makas 1	Dünya Hassas Aletler	Hayır. 91500-09	Düz uç
Yaylı makas 2	Dünya Hassas Aletler	No. 91501-09	Düz uç
Stereotaksik platform	KOPF (Türkçe)	Modeli: 900LS
Cerrahi forseps 1	ELEKTRON MIKROSKOBU BILIMLERI	Kedi Günlüğü # 0508-5 / 45-PO	Stil 5/45, kavisli
Cerrahi forseps 2	ELEKTRON MIKROSKOBU BILIMLERI	kedi günlüğü # 0103-5-PO	Stil 5, düz
Cerrahi forseps 3	ELEKTRON MIKROSKOBU BILIMLERI	kedi günlüğü# 72912
Cerrahi forseps 4	ELEKTRON MIKROSKOBU BILIMLERI	Kedi Günlüğü # 0508-5 / 45-PO	Stil 5/45, kavisli
Ameliyat lambası	Leica Belediyesi	Leica KL300 LED
Vetbond Doku Yapıştırıcısı	3M Hayvan Bakımı	Parça Numarası: 014006

Belediyesi Serisi )