Bir Mikroakışkan Çip İçinde Sıçan Hipokampal Nöronlarının Floresan İmmün Boyanması

Özet

Kaynak: Nagendran, T., et al., Primer Murin Nöronlarını Bölümlere Ayırmak için Önceden Monte Edilmiş Plastik Mikroakışkan Çiplerin Kullanımı. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, nöronal olgunlaşmayı ve bağlantıyı analiz etmek için mikroakışkan bir çip içinde kültürlenen sıçan hipokampal nöronlarının immünofloresan boyamayı göstermektedir.

Protokol

1. Çip İçinde Floresan İmmün Boyama

1. PBS'de% 4 formaldehit fiksasyon çözeltisi hazırlayın (% 4 formaldehit, 1 μM MgCl₂, 0.1 μm CaCl₂, 120 mM sükroz)
2. Çipin kuyucuklarındaki ortamın çoğunu çıkarın (iç bölmeleri kurutmayın).
3. Aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyucuklarına hemen 100 μL sabitleme solüsyonu ekleyin.
4. 1 dakika sonra, alt kuyucuklara 100 μL sabitleme çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika sabitleyin.
5. Çözeltinin çoğunu çipin kuyularından çıkarın (iç bölmeleri kurutmayın). Aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyucuklarının her birine hemen 150 μL PBS ekleyin. PBS'nin alt kuyulara akması için 2 dakika bekleyin.
6. Adım 1.5'i iki kez tekrarlayın.
7. PBS'nin çoğunu çipin kuyularından çıkarın. Hemen% 0.25 TritonX-100 içeren 150 μL PBS'yi, aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyucuklarının her birine ekleyin. 15 dk bekleyin.
8. Sıvının çoğunu çipin kuyucuklarından çıkarın ve aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyucuklarının her birine hemen 150 μL bloke edici çözelti (PBS'de% 10 normal keçi serumu) ekleyin. 15 dk.
   bekleyin not: Etkili bloke etme solüsyonları ikincil antikora özgü olmalıdır, ör., bir eşek anti-koyun ikincil antikoru için, bloke edici solüsyonda eşek serumu kullanın.
9. Sıvının çoğunu çipin kuyucuklarından çıkarın ve hemen aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyucuklarının her birine PBS'de% 1 normal keçi serumunda 100 μL birincil antikor (veya antikorlar) ekleyin. Buharlaşmayı en aza indirmek için örtün ve oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C bekleyin.
10. Çözeltinin çoğunu çipin kuyularından çıkarın (iç bölmeleri kurutmayın). Aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyucuklarının her birine hemen 150 μL PBS ekleyin. PBS'nin alt kuyulara akması için 5 dakika bekleyin.
11. Adım 1.10'u iki kez tekrarlayın.
12. Sıvının çoğunu çipin kuyucuklarından çıkarın ve hemen aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyucuklarının her birine PBS'de 100 μL ikincil antikor (veya antikor) ekleyin. Buharlaşmayı en aza indirmek için üzerini örtün ve oda sıcaklığında 1 saat bekleyin.
    not: İkincil antikorların önerilen seyreltilmesi için üreticinin talimatlarına bakın.
13. 1.10-1.11 arasındaki adımları tekrarlayın.
14. İmmün boyamadan sonraki 1 gün içinde görüntüleme yapıyorsanız, çipi PBS ile dolu tutun. Çip, görüntülemeden önce 1 günden daha uzun süre saklanacaksa, buharlaşmayı önlemek için çipi içeren kabı parafin filme sarın ve görüntüye hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
15. Numunelerin daha uzun süreli saklanması için montaj ortamı (örn. Fluoromount-G) kullanılabilir.
    1. Sıvının çoğunu çipin kuyularından çıkarın. Aksonal ve somatik bölmelerin üst kuyucuklarının her birine 2 damla montaj ortamı eklemek için 1 mL tek kullanımlık plastik pipet kullanın.
    2. Montaj ortamının kanallardan akışını teşvik etmek için çipi eğin. 5 dakika sonra, alt kuyucuklara 2 damla ekleyin. Görüntülemeden önce 1 saat bekleyin.
       not: Montaj ortamını kullandıktan sonra, diğer hedefler için yeniden araştırma yapmak mümkün olmayacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Xona Çip	Xona Mikroakışkanlar, LLC	İkinci El XC150	150 μm uzunluğunda mikro oluk bariyeri
Xona Çip	Xona Mikroakışkanlar, LLC	XC450	450 μm uzunluğunda mikro oluk bariyeri
Xona Çip	Xona Mikroakışkanlar, LLC	XC900	900 μm uzunluğunda mikro oluk bariyeri
XC ön kaplama	Xona Mikroakışkanlar, LLC	XC Ön Kaplama	XonaChips'e dahildir
XonaPDL (XonaPDL)	Xona Mikroakışkanlar, LLC	XonaPDL (XonaPDL)
Nörobazal ortam	ThermoFisher Bilimsel	21103049
Cam Pastör pipetleri	Sigma-Aldrich	CLS7095D5X SIGMA
% 16 formaldehiti delin	ThermoFisher Bilimsel	28906
PBS (10 kat)	ThermoFisher Bilimsel	QVC0508
Normal keçi serumu	ThermoFisher Bilimsel	16210064
Triton X-100	ThermoFisher Bilimsel	28314
Anti-vGlut1 antikoru	NöroMab	75-066	klon N28/9, 1:100
Alexa Fluor ikincil antikorları	ThermoFisher Bilimsel		17:40
Eğirme diski konfokal görüntüleme sistemi	Andor Teknolojisi	CSU-X1, iXon X3 EMCCD	60x silikon yağı ve 20x objektif