Sıçan Kortikal Nöronlarında Filamentli Aktin Punktasının Miktar Tayini

Özet

Kaynak: Li, H., et al. Sıçan Kortikal Nöronlarında Filamentli Aktin (F-aktin) Puncta'nın Miktar Tayini. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, mikroskopi için sıçan kortikal nöronlarının floresan olarak boyanması prosedürünü göstermektedir. Yapısal bütünlüğü analiz etmek ve nöronal fonksiyon ve sağlığı incelemek için çok önemli olan F-aktin yoğunluğunu hesaplamak için F-aktin ve dendritik proteinleri hedefler.

Protokol

1. Floresan Etiketleme ve İmmünositokimya

Not: Primer kortikal hücre kültürlerinin immünofloresan etiketlemesi, çalışma hacmi 1 ml olan cam tabanlı 35 mm hücre kültürü kaplarında gerçekleştirilmiştir.

1. Cam tabanlı kabı fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4 (PBS) ile iki kez yıkayın.
2. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
3. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve PBS'de% 0.1 Triton X-100 ile 5 dakika boyunca geçirgenleştirin.
4. Hücreleri RT'de 20 dakika boyunca F (filamentli) aktin spesifik bir boya, AlexaFluor 488 Phalloidin (1 ml PBS'de 1:40, 25 μl Phalloidin) ile tedavi edin.
5. Hücreleri PBS ile iki kez durulayın ve RT'de 1-2 saat boyunca% 10 normal keçi serumu ile bloke edin.
6. PBS'deki tavuk poliklonal anti-MAP2 (mikrotübül ile ilişkili protein 2) antikorunu (1: 2.500) %2 normal keçi serumu ile seyreltin ve O/N'yi (gece boyunca) 4 ⁰° C'de inkübe edin.
7. İnkübasyondan sonra, PBS'de iki kez durulayın.
8. İkincil antikoru (Alexa Red 594-konjuge keçi anti-tavuk IgG (1:500)% 2 normal keçi serumu ile seyreltin ve RT'de 2 saat inkübe edin.
9. PBS ile durulayın ve 10 μl/tabak Hoescht boyası ekleyin.
10. RT'de 3 dakika inkübe edin ve PBS ile iki kez yıkayın.
    not: Etiketli hücreler artık 2. adım için hazırdır (F-aktin punkta sayımı).
11. Hücre örneğini 100 μl antifade reaktifi ile bir örtü maddesi olarak koruyun ve uzun süreli saklama için karanlıkta 4 0 ° ^C'detutun.
    not: Phalloidin, PBS'de karanlıkta +4 °C'de 1 haftaya kadar nispeten stabildir ve floresan, antifade örtü kayma reaktifleri ile korunabilir. Bununla birlikte, boyamadan 1-3 gün sonra optimal görüntüler elde edilir, çünkü Phalloidin uzun süreli depolama ile yayılmaya başlayabilir.

2. F-aktin Puncta Sayımı

1. Floresan mikroskobu açın ve 20× objektife geçin. Mikroskop yazılımını açın ve 1× yakınlaştırmada 1280×960 piksel görüntü boyutunda ve 0.17 μm/piksel görüntü çözünürlüğünde programı ayarlayın.
2. Yeşil (495 nm) veya kırmızı (613 nm) floresan kanallar altında birlikte etiketlenmiş F-aktin / MAP2 nöronlarının görüntülerini elde edin.
3. Açıkça tanımlanmış dendritik arborslara sahip bireysel nöronların 5 Yeşil (F-aktin)/Kırmızı (MAP2) immün etiketli/Mavi (Hoescht) floresan görüntüsünü seçin.
4. Sürekli MAP2 immünofloresan ile ikinci dereceden dendritik segmentteki (uzunluk aralığı 25-75 μm) F-aktin açısından zengin yapıları tanımlayın.
5. Görüntülerin seçili bölgesini yatay bir düzeye döndürün. Yeni bir görüntü olarak kopyalayıp yapıştırın.
6. Her yemek için tutarlı bir ayar kullanarak görüntülerin arka planını çıkarın.
7. Parlak yeşil F-aktin punktasını sayın ve seçilen dendritik segmentin uzunluğunu eğitimli bağımsız gözlemciler tarafından manuel olarak izleyin. Verileri bir elektronik tablo dosyasına aktarın.
8. Toplam F-aktin etiketli punktayı (N) MAP2 etiketli dendritlerin uzunluğuna (L) bölerek yoğunluğu hesaplayın. Verileri 10 μm dendrit
   başına F-aktin punkta sayısı olarak ifade edin not: Dendritik şafttaki ortalama lekelenme yoğunluğunun en az% 50 üzerinde bir tepe yoğunluğuna sahip F-aktin floresansının punkta (boyut ≤1.5 μm), seçilen her dendritik segmente dahil edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
35 mm Cam Alt Tabaklar No. 1.5 kapak camı	MatTek Şirketi	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 orta	Yaşam Teknolojileri	10565-018
Poli-L-Lizin	Sigma	P9155
Paraformaldehit	Sigma	P6148 Serisi
AlexaFluor 488 Phalloidin	Yaşam Teknolojileri	A12379
Normal at serumu	Yaşam Teknolojileri	26050-070
Tavuk poliklonal anti-MAP2	abcam (abcam)	Ab92434
Alexa Kırmızı 594 konjuge keçi anti-tavuk IgG	Yaşam Teknolojileri	A11042
NucBlue Canlı hücre lekesi ReadyProbes Reaktif Hoescht 33342	Yaşam Teknolojileri	R37605
NIS-Elements yazılım paketi	Nikon Enstrümanları
Nikon Eclipse TE2000-E ters floresan bilgisayar kontrollü mikroskop	Nikon Enstrümanları

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi