Beyin Dokusu Ekstraktından Amiloid Fibrillerin İzolasyonu

Özet

Kaynak: Upadhyay, A. ve diğerleri, Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve amiloid olmayan proteinlerin sindirimi kullanılarak fare beyin dokusu ekstraktından amiloid fibrilleri izole etme protokolünü göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Doku toplama ve amiloid saflaştırma

NOT: İdeal olarak, amiloid fibriller yeni diseke edilmiş beyin bölgelerinden izole edilmelidir. Bununla birlikte, bu yöntem aynı zamanda çıtçıt veya flaşla donmuş beyin dokularında da iyi çalışır. Aşağıda, daha sonra kullanılmak üzere saklanmak üzere dondurulan beyin dokularının kısa bir özeti bulunmaktadır.

1. Beyin dokusu toplama ve depolama: Fare beyinlerini inceleyin ve amiloid yüklü bölgeleri (yani korteks ve hipokampus) hızlı bir şekilde hasat edin, ardından sıvı nitrojen veya kuru bir buz alkol banyosunda hızlı dondurma işlemi yapın.
   not: Çıtçıt dondurma, doku bileşenlerinin yapısal özelliklerinin korunmasına yardımcı olur. Fareler izofluran ve servikal çıkık ile ötenazi yapılır. Beyin proteom bütünlüğünü tehlikeye atabileceğinden CO₂ kullanmaktan kaçınılması tavsiye edilir.
2. Diseksiyon sonrası, taze dokuları küçük bloklar halinde (örn. 5 mm x 5 mm) kesin ve saklayın, çünkü bu, amiloid ekstraksiyonundan önce daha verimli homojenizasyonu kolaylaştırır. Dokuyu steril kriyojenik şişeye aktarın, kapağını sıkın ve hızla daldırın.
3. Dokuları ultra soğuk koşullarda donmuş halde tutun (ör. -80 °C veya sıvı nitrojen). Ekstraksiyon birkaç gün sonra yapılacaksa, dokuları -20 °C'de saklayın ve donma ve çözülme döngülerinden kaçının. Ekstraksiyon ve saflaştırma için hazır olduğunda donmuş dokuları ıslak buz üzerinde çözdürün.
   not: Dokuların sıvı nitrojen ile doğrudan teması, doku ve protein hasarına neden olabilir. Bir alkol banyosunun tüp etiketlerinden kalıcı işaretleyicileri çıkarabileceğini unutmayın.

2. Sodyum dodesil sülfat (SDS) çözünmeyen malzemenin zenginleştirilmesi

>NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm adımları buz ve santrifüj üzerinde 4 °C'de gerçekleştirin. Kimyasalların ve aletlerin üreticileri ve katalog numaraları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. 6-8 seramik boncuk ve taze hazırlanmış buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu (0.25-1 g ıslak doku kütlesi için 1 mL) içeren 2 mL'lik bir tüpe yerleştirilmiş taze diseke edilmiş veya çıtır donmuş beyin dokusu bölgeleri (buz üzerinde çözülmüş) ile başlayın.
2. Tüpleri boncuk değirmeni homojenizatörüne aktarın ve doku içeriğini her biri 30 s'lik iki döngü ve aralarında 30 sn aralıklarla 4000 rpm'de öğütün.
   not: Alternatif olarak, dokuları öğütmek ve homojenize etmek için motorlu karıştırıcı veya homojenizatör sistemleri kullanılabilir.
3. 15 mL'lik tüplerde 1 mL beyin tüm doku homojenatına 9 mL buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu ekleyin, laboratuvar balmumu film şeritleri ile kapatın ve sağlam çözünme sağlamak için gece boyunca 4 °C'de uçtan uca döndürün.
   not: İstenmeyen büyük hücresel kalıntıları ve lipitleri çıkarmak için, ertesi sabah, tüpleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de 800 x g'da döndürün ve süpernatanı yeni bir tüpte toplayın. Kalan peleti 2 mL buz gibi soğuk homojenizasyon tamponunda tekrar süspanse edin, iyice karıştırın, 4 °C'de 10 dakika tekrar döndürün ve iki süpernatanı birleştirin.
4. Doku özü süspansiyonuna 1.2 M'lik bir nihai konsantrasyona yavaşça katı sükroz ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C'de 45 dakika boyunca 250.000 x g'da santrifüjleyin.
5. Bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın. Pelet, 1.9 M sükroz içeren 2 mL homojenizasyon tamponu içinde tritüre edilerek yeniden süspanse edilir, ardından 4 ° C'de 45 dakika boyunca 125.000 x g'da santrifüj edilir
   not: Tampon hacmi, önceki adımdan geri kazanılan malzeme miktarına göre ayarlanabilir. Genel olarak, 10 hacim homojenizasyon tamponu (V/V) bu adım için idealdir.
6. Bir pipet kullanarak üstteki beyaz katı tabakayı toplayın, yeni bir tüpe aktarın ve hava kabarcıkları oluşturmadan birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 1 mL buz gibi soğuk yıkama tamponunda çözündürün.
7. Üst tabakanın yanı sıra, pelet ayrıca amiloid fibrilleri ile zenginleştirilmiştir. Daha yüksek bir verim için iki fraksiyonu birleştirin ve devam edin. Bir pipet kullanarak orta sulu tabakayı dikkatlice çıkarın ve atın.
8. Kombine fraksiyonları 8000 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
9. Yıkanmış pelete 1 mL buz gibi soğuk sindirim tamponu ekleyin, yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında (RT) 3 saat inkübe edin.
10. 8000 ° C'de 20 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipet kullanarak çıkarın.
11. Sindirilmiş peleti 1 mL buz gibi soğuk Tris tamponunda iki kez yeniden süspanse edin ve yıkayın (Adım 2.8 ile aynı).
12. Yıkanmış peleti, yukarı ve aşağı pipetleyerek %1 SDS ve 1.3 M sükroz içeren 1 mL çözündürme tamponunda yeniden süspanse edin. 4 °C'de 60 dakika boyunca 200.000 x g'da hızlı bir şekilde santrifüjleyin.
    not: Amiloid fibriller deterjanlara ve denatürantlara karşı oldukça dirençli olmasına rağmen, deterjana çok uzun süre maruz kalmak (%1 SDS) fibrillerin bütünlüğünü etkileyebilir veya sıkıca bağlı proteinleri uzaklaştırabilir, bu da sonraki analizleri tehlikeye atacaktır. Bu nedenle, peletleri yeniden askıya aldıktan hemen sonra santrifüjlemeye devam edin.
13. Sükroz konsantrasyonunu 1,3'ten 1 M'ye düşürmek için 50 mM Tris tamponu (1:0,3 oranında) ekleyerek peleti koruyun ve kalan süpernatantın hacmini artırın ve 4 °C'de 45 dakika boyunca 200.000 x g'da bir kez daha santrifüjleyin.
14. İki peleti% 0.5 SDS içeren 100 μL Tris tamponunda çözün ve amiloid saflaştırması için havuzlayın. Görünür peletler küçüktür ve opak ve kirli beyaz görünmelidir (bkz. Şekil 1A).

Sonuçlar

Şekil 1: Biyokimyasal boyama ve amiloid fibrillerin görüntülenmesi kullanılarak amiloid ekstraksiyonunun doğrulanması. (A) Zenginleştirilmiş amiloid içeren SDS çözünmeyen pelet, opak, kirli beyaz renkte görünür. (B) 0.45 μm nitroselüloz membran üzerinde lekelenmiş saflaştırılmış amiloid içeren SDS'de çözünür süpernatan ve SDS'de çözünmeyen peletin Kongo kırmızısı boya...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Proteaz inhibito	Termo Bilimsel	164535	Diğer üreticilerin alternatif aletleri, kimyasalları ve antikorları kullanılabilir
Kalsiyum Klorür	Sigma-Aldrich	C1016	Diğer üreticilerin alternatif aletleri, kimyasalları ve antikorları kullanılabilir
Kollajenaz	Sigma-Aldrich	C0130	Diğer üreticilerin alternatif aletleri, kimyasalları ve antikorları kullanılabilir
Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Sigma-Aldrich	11697498001	Diğer üreticilerin alternatif aletleri, kimyasalları ve antikorları kullanılabilir
Dnase I	Thermo Fisher Bilimsel	EN0521	Diğer üreticilerin alternatif aletleri, kimyasalları ve antikorları kullanılabilir
K54 Doku Homojenizasyon Sistemi Motoru	Cole Parmer	Glas-Col 099C	Diğer üreticilerin alternatif aletleri, kimyasalları ve antikorları kullanılabilir
Optima L-90K Ultrasantrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	BR-8101P-E	Diğer üreticilerin alternatif aletleri, kimyasalları ve antikorları kullanılabilir
Precellys 24 doku homojenizatörü	Bertin Enstrümanları	P000062-PEVO0-A	Diğer üreticilerin alternatif aletleri, kimyasalları ve antikorları kullanılabilir
Sodyum dodesil sülfat (SDS)	Sigma-Aldrich	74255	Diğer üreticilerin alternatif aletleri, kimyasalları ve antikorları kullanılabilir
Sorvall Legend Mikro 21R Mikrosantrifüj	Thermo Fisher Bilimsel	75002446	Diğer üreticilerin alternatif aletleri, kimyasalları ve antikorları kullanılabilir
Tris-HCl	Thermo Fisher Bilimsel	15568025	Diğer üreticilerin alternatif aletleri, kimyasalları ve antikorları kullanılabilir

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi