Yenidoğan Fare Beyninde Murin Sitomegalovirüs Dağılımını Analiz Etmek için İntraserebroventriküler Enjeksiyon

Özet

Kaynak: Kawasaki, H., et al. Viral Partiküllerin ve Floresan Mikroboncukların Yenidoğan Beynine İntraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, yenidoğan fare beyninde murin sitomegalovirüs (MCMV) dağılımını incelemek için intraserebroventriküler enjeksiyon sürecini göstermektedir. Görünürlük için gelişmiş bir yeşil floresan proteini (EGFP) ifade etmek üzere tasarlanan MCMV, bir fare yavrusunun beyninin yan ventrikülüne enjekte edilir. Enjekte edilen virüs, beyin omurilik sıvısında dolaşır ve marjinal bölge, koroid pleksus ve subventriküler bölge dahil olmak üzere periventriküler bölgedeki hücreleri enfekte eder.

Protokol

1. Yenidoğan Farelere MCMV ve Floresan Mikro Boncukların ICV Enjeksiyonu

1. Normal hamile ICR farelerini 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü altında sıcaklık kontrollü bir tesiste tutun. Yenidoğanlar doğum günü P 0.5 olarak adlandırılır.
2. 10 μl'lik bir şırıngayı ve 27 G'lik bir iğneyi% 70 alkolle sterilize edin.
3. MCMV veya floresan mikro boncuklar içeren enjeksiyon solüsyonunu (5 μl) şırınganın pistonunu dikkatlice çekerek iğneye yükleyin.
4. Fareyi 3-4 dakika boyunca buza koyarak yenidoğan faresini (P 0.5) kısıtlayın. Hayvan anestezi altına alındıktan sonra, anestezi derinliğini belirlemek için ayak parmağını kıstırma tepki yöntemini kullanın.
5. Enjeksiyon bölgesini toksik olmayan bir laboratuvar kalemi ile sagital sütürden yaklaşık 0.7 - 1.0 mm lateral ve neonatal bregmadan 0.7 - 1.0 mm kaudal bir yerde işaretleyin (Şekil 1A).
6. İğneyi 2 mm derinliğinde, işaretli enjeksiyon bölgesinde kafatası yüzeyine dik olarak yerleştirin. Referans olarak, toksik olmayan bir yapıcı ile iğnenin ucundan 2 mm işaretleyin.
7. Kafa derisini açmadan lateral ventriküle yavaşça 5 μl MCMV (yaklaşık 5 ×^{10 5} PFU) enjekte edin (Şekil 1B).
8. Başka bir fare grubunda, aynı yöntemle floresan mikroboncuklar (0.1 - 0.3 μm, yaklaşık 5.75 × 10⁸ parçacık) içeren 5 μl'lik bir çözelti enjekte edin.
9. Geri akışı önlemek için piston hareketini durdurduktan 10 - 20 saniye sonra iğneyi yavaşça çıkarın.
10. İyileşmek için, fareleri hareket ve genel tepki geri gelene kadar ılık bir kapta 5-10 dakika tutun.
11. Enjeksiyondan sonra beyinleri çeşitli zaman noktalarında (3, 12, 24, 48 ve 72 saat) hasat edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Yenidoğan faresinin enjeksiyon bölgeleri. (A, B) 5 μl MCMV (yaklaşık 5 × 10⁵ PFU) veya 5 μl mikro boncukların (yaklaşık 5.75 × 10⁹ partiküller) ICV enjeksiyonu. (A) Enjeksiyon bölgesi kulak ve göz arasındaki orta noktadadır (sagital sütürün yaklaşık 0.7 - 1.0 mm lateralinde ve neonatal bregmadan 0.7 - 1.0 mm kaudal bir yerde). (B) Kafata...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
SPHERO TM Floresan Polistiren Nil Kırmızısı 0.04-0.06	Spherotech, Inc. Tüm hakları saklıdır.	FP-00556-2
SPHERO TM Floresan Polistiren Nil Kırmızısı 0.1-0.3	Spherotech, Inc. Tüm hakları saklıdır.	FP-0256-2
SPHERO TM Floresan Polistiren Nil Kırmızısı 1.7-2.2	Spherotech, Inc.	FP-2056-2
% 10 fare serumu	DAKO	X0910
C57BL/6 fare	SLC, Inc. (İngilizce)
ICR fare	SLC, Inc. (İngilizce)
Modifiye Mikrolitre Şırıngalar (7000 Serisi)	Hamilton şirketi
35 gauge iğne	Saito Tıbbi
pEGFP-N1 vektörü	Clontech teknolojisi	#6085-1

Serisi Serisi Serisi Serisi