Yöntem makalesi

Periventriküler Endotel Hücrelerinden Kemoçekici İpuçlarına İnternöron Yanıtının Değerlendirilmesi

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Datta, D., et al. İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için Migrasyon, Kemo-Çekim ve Ko-Kültür Testleri. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu videoda, periventriküler endotel hücrelerinden (PVEC'ler) gelen kemoçekici ipuçlarına yanıt olarak nöronlar arası göçü test etmek için bir yöntem gösterilmektedir. İnternöronlar, her iki tarafta PVEC'ler ve kontrol hücreleri ile merkezi bir bölmeye yerleştirilir. PVEC'lere yönelik artan göç, kemoçekici sinyallerine olumlu bir yanıt olduğunu gösterir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kemo-çekim Testi

  1. Steril cımbız kullanarak poli-L-ornitin/laminin kaplı 35 mm'lik bir tabağın ortasına üç oyuklu bir kültür eki yerleştirin.
  2. Çanağı ters çevirin. Ultra ince uçlu kalıcı siyah bir işaretleyici kullanarak ek parçanın orta bölmesinin etrafındaki sınırı işaretleyin.
  3. Tohum 3 x 1070 μL nöronal ortamda orta bölmede 4 insan GABAerjik internöronları (Şekil 1A).
  4. Tohum 104 insan periventriküler endotel hücresi 70 μL periventriküler endotel hücre ortamında ve 104 kontrol endotel hücresi iki dış bölmede sırasıyla 70 μL kontrol endotel hücre ortamında (Şekil 1A).
  5. Tabak üzerindeki kaplamanın kurumasını önlemek için tabağın kenarına 1 mL ko-kültür ortamı (GABA içermeyen %50 periventriküler bakım ortamı ve %50 nöronal ortam) ekleyin.
  6. Hücrelerin ek bölmeden sızmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin.
  7. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin. 24 saatlik inkübasyondan sonra, hücrelerin düzgün şekilde bağlandığını ve sızıntı olmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin.
  8. 48 saatlik tohumlamadan sonra, steril bir cımbız kullanarak eki nazikçe çıkarın. Hücre tabakasının bozulmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin (0. gün).
  9. Ortamı çıkarın ve 1 mL taze ko-kültür ortamı ekleyin.
    NOT: 0. gün görüntüleri için gerekli sayıda yemek ayırın.
  10. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 36 saat inkübe edin. 36 saat sonra, ortamı aspire edin, hücreleri 10 dakika boyunca% 4 PFA ile sabitleyin ve 3x'i 1x PBS ile yıkayın.
  11. İnsan GABAerjik internöronlarını anti-insan β-Tubulin veya anti-insan MAP2 antikoru ile boyayın. Boyama prosedürünün sonunda, her yemeğe 1 mL antifade montaj ortamı ekleyin.

2. Görüntüleme ve Veri Analizi

  1. İmmüno-lekeli tahlil kabını 4X büyütmede mikroskop altına yerleştirin.
  2. Dikdörtgen kenarlığın bir uzun kenarını (yukarıdaki adım 5.10'da yapılmıştır) görüş alanında tutun. Bu sınırın bitişiğindeki hücresiz alandaki hücrelerin görüntülerini çekin. Dikdörtgen kenarın sağ uzun kenarı ve sol uzun kenarı boyunca görüntüler elde edin.
    NOT: Dikdörtgene göre çapraz olarak konumlandırılan hücreler, başlangıç işareti olarak kısa veya uzun kenarın seçilmesindeki belirsizlik nedeniyle dikkate alınmaz. Ayrıca, kısa kenar boyunca göç eden hücrelerin sayısı genellikle önemli ölçüde daha azdır (muhtemelen kısa kenar boyunca daha az sayıda başlangıç hücresi nedeniyle) ve dikkate alınmaz.
  3. Görüntüleri ImageJ'de açın. ImageJ kullanarak her hücre ile sınır işareti arasındaki mesafeyi hesaplayın.
  4. Göçü hücre sayıları açısından değerlendirmek için, ImageJ'de elde edilen görüntüdeki sınırdan belirli bir mesafe ayarlayın. Bu mesafe içinde bulunan hücrelerin sayısını sayın. Ortalama sayıyı hesapla, standart devia
  5. tion ve uygun yazılım kullanarak istatistiksel anlamlılık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1: Kemo-çekim testi. (A) Kemo-çekim testinin şeması. Üç oyuklu bir kültür eki kullanılarak, internöronlar (IN) ortada (yeşil noktalı dikdörtgen) ekilirken, periventriküler endotel hücreleri (PV EC'ler; turuncu noktalı dikdörtgen) ve kontrol endotel hücreleri (EC'ler; sarı noktalı dikdörtgen) her iki tarafa da ekildi. (B) Periventriküler endotel hücrelerine doğru güçlü göç gösteren, ancak kontrol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnsan endotel hücrelerini kontrol edinHücresel DinamikR1022
Kontrol endotel Hücreleri Orta TakviyesiHücresel DinamikM1019
DMEMF/12 ortaThermofisher Bilimsel11320033
E6 ortaThermofisher BilimselA1516401
FGF2Thermofisher BilimselPHG0261
FibronektinThermofisher Bilimsel33016-015
GABA (GABA)Sigma-AldrichA2129
HematidometreSigma-AldrichZ359629
İnsan GABAerjik nöronlarıHücresel DinamikR1013
İnsan GABAerjik nöronları temel ortamHücresel DinamikM1010
İnsan GABAerjik nöron Nöral takviyesiHücresel DinamikM1032
LamininSigmaL2020
Montaj OrtamıVektör laboratuvarlarıH-1200
poli-L-ornitinSigmaP4957 Serisi
PbsThermofisher Bilimsel14190
VEGF-APeprotech teknolojisi100-20
VascuLife VEGF Medium Komple KitYaşam Hattı Hücre TeknolojileriLL-0003 (Kontrol insan endotel hücre ortamının bileşeni
3 kuyucuklu silikon kültür-Insert ibidi80369
35 mm çanakCorning430165
% 4 PFA çözeltisiBalıkçı BilimselAAJ19943K2
Ters faz kontrast mikroskobuZeissZeiss Eksen Üstü 40C
Floresan mikroskobuOlympusFSX-100
Anti-insan β-Tubulin antikoruBiyoefsane802001
Anti-MAP2 antikoruNöromiklerCH22103
Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Yılı Serisi arası İngilizce)

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Interneuron MigrationChemoattraction AssayThree Compartment CultureGABAergic InterneuronsCell Migration AnalysisCo Culture MethodEndothelial Cell ControlPoly L Ornithine Coating

İlgili makaleler