Motor Nöron Lizatından Hedef Protein-DNA Komplekslerinin İmmünopresipitasyonu

Özet

Kaynak: Montanera, K. N. ve diğerleri, Rhee, H. S. Kromatin İmmünopresipitasyon-Eksonükleaz (ChIP-Exo) Kullanarak Fare Kök Hücre Türetilmiş Nöronlarında Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, hedef proteine özgü antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak kök hücre türevli motor nöron lizatlarından hedef protein ile çapraz bağlanmış DNA fragmanlarının immünopresipitasyonunu göstermektedir.

Protokol

NOT: Tamponlar ve reaksiyon ana karışımları yapmak için otoklavlanmış damıtılmış ve deiyonize su (ddH₂O) önerilir.

1. Hücrelerin toplanması ve çapraz bağlanması

1. Fare embriyonik kök (ES) hücrelerini postmitotik nöronlara farklılaştırdıktan sonra, hasat edilen hücrelere %11'lik bir nihai konsantrasyona (h/h) %1 formaldehit ekleyin. Oda sıcaklığında (RT, 25 °C) 15 dakika boyunca sallanan bir platform (külbütör, çalkalayıcı veya döndürücü) üzerinde kaya hücreleri.
   not: Çapraz bağlanacak hedef proteine bağlı olarak, daha az formaldehit çapraz bağlama (örneğin, %0.5'lik bir nihai konsantrasyon) veya diseksinimidil glutarat (DSG) ile çift çapraz bağlama kullanılabilir.
2. Çapraz bağlanma reaksiyonunu durdurmak için 150 mM'lik bir nihai konsantrasyona 2,5 M glisin ekleyin. RT'de sallanan bir platformda 5 dakika boyunca kaya hücreleri.
3. Çapraz bağlı hücreleri 15 mL konik tüplerde RT'de 6 dakika, 1.350 x g'da santrifüjleyin. Çözeltiyi aspire edin, ardından hücreleri 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin.
   not: Çapraz bağlı hücre peletleri, sıvı nitrojen ile hızlı dondurma işleminden sonra -80 °C'de saklanabilir.

2. Hücre parçalanması

>NOT: Bu protokoldeki aşağıdaki adımlar, fare ES hücrelerinden farklılaşmış yaklaşık 2 x 10⁷ nöronal hücreler içindir. Açık hücreleri kırmak için çeşitli deterjanlar içeren lizis tamponları kullanılacaktır. Kullanmadan hemen önce 50 mL tampona 50 μL 1000x tam proteaz inhibitörü (CPI) stoğu ekleyin.

1. Lizis tamponları 1-3'ü Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
2. Çapraz bağlı hücre peletlerini buz üzerinde çözün, ardından hücre peletlerini 15 mL konik tüplerde 1 mL lizis tamponunda iyice yeniden süspanse edin. Sallanan bir platformda 4 °C'de 15 dakika sallanın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.350 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
3. Peletlenmiş hücreleri 3 mL lizis tamponu 2 içinde iyice yeniden süspanse edin. Sallanan bir platformda 4 °C'de 10 dakika sallayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.350 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
4. Her pelete 1 mL lizis tamponu 3 ekleyin, ardından buz üzerinde tutun. Hemen sonikasyona devam edin.

3. Sonikasyon kromatini

NOT: Çapraz bağlantının tersine çevrilmesini azaltmak için bu sonikasyon prosedürü sırasında numuneleri buz üzerinde veya 4 ° C'de tutun.

1. Steril bir spatula kullanarak, 15 mL polistiren tüplerde 0,2 mL mezuniyet işaretine kadar sonikasyon boncukları (Malzeme Tablosu) ekleyin. Sonikasyon boncuklarını, kuru noktalar görünmeyene kadar 600 μL 1x PBS'de girdap yaparak yıkayın. Tüpleri 5 saniye boyunca 30 x g'da santrifüjleyin ve 1x PBS.
   aspire edin not: Polistiren tüplerde sonikasyon, polipropilen tüplerde sonikasyondan daha verimlidir. Daha az sayıda hücre (örneğin, <10⁶ hücre) sonikasyona uğrarsa, sonikasyon boncukları eklemeden 1.5 mL polistiren tüpler kullanın.
2. Nükleer lizatları 1 mL lizis tamponu 3 (adım 2.4'ten) içinde iyice yeniden süspanse edin, daha sonra sonikasyon boncukları içeren 15 mL polistiren tüplere aktarın. Polistiren tüpleri kısaca girdaplayın.
3. Çapraz bağlı kromatin DNA'sını parçalamak için, 30 W'ta güç genliği ve 30 s açık / 30 s kapalı olarak ayarlanmış sonikasyon döngüleri ile optimize edilmiş bir döngü sayısı için 4 ° C'de nükleer lizatları sonikleştirin.
   not: Her hücre tipi ve parti için sonikasyonun optimizasyonu, en iyi kromatin immünopresipitasyon-eksonükleaz (ChIP-exo) verimi ile sonuçlanacaktır. 2 x 10⁷ fare nöronal hücresi için, belirtilen ayarlarda 20−30 sonikasyon döngüsü, kromatini 100−500 bp aralığında parçalayacaktır.
4. Sonikasyon tamamlandıktan sonra, her numuneden tüm süpernatanı (sonikasyonlu lizatlar) 1.5 mL tüplere aktarın. Her numuneye %1'lik bir nihai konsantrasyonda %10 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoksi]etanol) ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
5. Pelet hücresi kalıntıları için, numuneleri 13.500 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Her numuneden tüm sonikasyonlu lizatları (süpernatant) yeni 1.5 mL tüplere aktarın.
6. Her numuneden 30 μL sonikasyonlu lizat alın (sonikasyonlu lizatın ~% 3'ü) ve sonikasyonu kontrol etmek için yeni 1.5 mL tüplere ekleyin. Kalan sonikasyonlu lizatları, antikor kaplı boncuklarla inkübasyona hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.

4. Sonikasyonu kontrol etme

1. 2 mL 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2 mL 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), 10 mL %10 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 6 mL otoklavlanmış ddH₂O ekleyerek 20 mL 2x proteinaz K tamponu yapın. Bu arabelleğe CPI eklemeyin. RT'de 50 mL'lik tüpte saklayın.
2. Protein-DNA çapraz bağını tersine çevirmek için, proteinleri çıkararak, her numuneden 30 μL sonikasyonlu kromatini alın (adım 3.6'dan), 166 μL otoklavlanmış ddH₂O, 200 μL 2x proteinaz K tamponu ve 4 μL 20 mg / mL proteinaz K ekleyin. Numuneleri kısaca vorteksleyin ve daha sonra 24 x g'da 1-3 saat boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
3. NOT: Sonikasyonlu lizatlar, gece boyunca 65 ° C'de ters çapraz bağlanabilir.
4. Fenol: kloroform: izoamil alkol (PCIA: 25: 24: 1) ve etanol çökeltme yöntemini kullanarak DNA'yı aşağıdaki gibi çıkarın.
   Dikkat: PCIA toksiktir. Standart kişisel koruyucu ekipman (KKD) ile çeker ocak altında kullanın.
   1. 1.5 mL'lik tüplerdeki her numuneye 400 μL PCIA ekleyin, vorteksi maksimum hıza ayarlayın ve numuneleri 20 saniye boyunca vorteksleyin. RT'de 6 dakika boyunca 18.400 x g'da santrifüjleyin. İki aşama gözlenecektir. Her numunenin üst sulu tabakasını (berrak faz) dikkatlice yeni 1,5 mL'lik tüplere aktarın.
   2. 1 μL 10 mg / mL RNase A ekleyin. Örnekleri 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
   3. Her numuneye 1 μL 20 mg/mL glikojen ekleyin, ardından 1 mL buz gibi %100 etanol (-20 °C dondurucuda saklayın) ile çökeltin. Kısa bir süre karıştırın, ardından numuneleri -80 °C dondurucuda 30 dakika ila 1 saat inkübe edin. Numuneleri 18.400 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve dikkatlice %100 etanolü boşaltın.
   4. Peletleri 500 μL buz gibi %70 etanol ile yıkayın (-20 °C dondurucuda saklayın). 18.400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Dikkatlice% 70 etanolü dökün.
   5. Numuneleri, kalan etanol buharlaşana kadar 50 ° C'de 1,5 mL'lik tüplerde inkübe edin. DNA peletlerini 15 μL otoklavlanmış ddH2O veya nükleaz içermeyen ddH2O içinde yeniden süspanse edin.
   6. Ekstrakte edilen DNA örneklerini, bir DNA merdiveni ile birlikte, 120-180 V'ta% 1.5 agaroz jel içinde çalıştırın ve sonikasyonlu DNA'nın boyutunu kontrol edin.

>5. Boncuklarla antikor inkübasyonu

>NOT: Bu protokoldeki aşağıdaki adımlar, fare ES hücrelerinden farklılaşmış yaklaşık 2 x 10⁷ nöronal hücreler içindir. ChIP-exo protokolü sırasında herhangi bir noktada manyetik boncukları dondurmayın ve çözmeyin, çünkü boncuklar çatlayarak numunenin kontaminasyonuna neden olabilir veya antikorun performansı tehlikeye girebilir.

1. Hücre lizisi ve sonikasyondan sonra, ChIP için Protein G manyetik boncukları (Malzeme Tablosu) hazırlayın, manyetik boncukları homojen olana kadar karıştırın, ardından 2 mL protein düşük bağlama tüplerine 25 μL manyetik boncuk ekleyin.
   NOT: Kullanılan manyetik boncukların türü, antikorların türüne bağlı olacaktır.
2. Boncukları 1 mL bloke edici solüsyonla yıkayın (Tablo 1), iyice karıştırın, ardından 1 dakika manyetik bir rafa koyun. Hala manyetik bir raftayken, temizlendikten sonra süpernatanı çıkarın.
3. Manyetik boncuklara 1 mL bloke edici solüsyon ekleyin. Sallanan bir platform üzerinde 4 °C'de 10 dakika boyunca tüpleri sallayın. Kısa bir süre döndürün, ardından tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın.
4. Adım 5.3'ü iki kez daha tekrarlayın.
5. Manyetik boncuklara 500 μL engelleme çözeltisi ekleyin. Antikoru Isl1'e (0.04 μg/μL, Malzeme Tablosu) karşı kısaca döndürün, ardından bloke edici çözeltide manyetik boncukları içeren karşılık gelen 2 mL protein düşük bağlama tüplerine 4 μg antikor ekleyin.
6. Antikor olmadan adım 5.5'i tekrarlayın (yani, ChIP için antikor kontrolü yok).
   not: Eklenecek antikor miktarı, antikorun kalitesi ve ChIP için kullanılan hücre sayısı dikkate alınarak ampirik olarak belirlenebilir.
7. Sallanan bir platform üzerinde 6−24 saat boyunca 4 °C'de kaya örnekleri.

6. Kromatin immünopresipitasyonu (ChIP)

1. Adım 5.8'den itibaren antikor kaplı boncukları 1 mL bloke edici solüsyonla yıkayın. Numuneleri 5 dakika boyunca 4 °C'de sallanan bir platforma yerleştirin.
2. Adım 6.1'i iki kez daha tekrarlayın.
3. Antikor kaplı boncukları 50 μL bloke edici çözelti içinde yeniden süspanse edin, daha sonra yeni 2 mL protein düşük bağlama tüplerine aktarın. Her ChIP numunesi için, 2 mL protein düşük bağlama tüplerinde antikor kaplı boncuklara sonikasyonlu lizatlar (adım 3.6'dan ~ 1.0 mL) ekleyin.
4. Her bir numuneyi gece boyunca 4 °C'de sallanan bir platformda inkübe edin.

7. ChIP yıkamaları

NOT: ChIP yıkamaları sırasında protein-DNA çapraz bağını korumak için numuneleri buz üzerinde veya 4 °C'de tutun.

1. Tablo 10'de açıklandığı gibi yüksek tuzlu yıkama tamponu, LiCl yıkama tamponu ve 7.4 mM Tris-HCl tamponu (pH 2) yapın. 50 mL'lik tüplerde 4 °C'de saklayın. Kullanmadan hemen önce tüm tamponlara 50 μL 1000x CPI stoğu ekleyin.
2. Kapaklardan sıvı toplamak için numuneleri 2 mL protein düşük bağlama tüplerinde kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkarın.
3. ChIP yıkamaları için, her tüpe 1 mL lizis tamponu 3 (4 ° C'de) ekleyin. Sallanan bir platformda 4 °C'de 5 dakika karıştırın. Numuneleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın.
4. Her tüpe 1 mL soğuk yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin. Sallanan bir platformda 4 °C'de 5 dakika karıştırın. Numuneleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın.
5. Her tüpe 1 mL soğuk LiCl yıkama tamponu ekleyin. Sallanan bir platformda 4 °C'de 5 dakika karıştırın. Numuneleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın.
6. Her tüpe 1 mL soğuk 10 mM Tris-HCl tamponu (pH 7.4) ekleyin. Sallanan bir platformda 4 °C'de 5 dakika karıştırın. Numuneleri kısaca döndürün, ardından 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın.
   not: Tris-HCl tamponu (pH 7.4) yerine Tris-EDTA tamponu (pH 8.0) kullanılabilir.

Tablo 1: Lizis tamponları 1-3 ve bloke edici tamponlar için tarifler. 4 ° C'de 50 mL'lik tüplerde saklayın. Kullanmadan hemen önce tüm tamponlara 50 μL 1000x CPI (tam proteaz inhibitörü) stoğu ekleyin.

Lizis tamponu 1
reaktif	Hacim (mL)	[Final]
1 M HEPES (pH 7.3)	2,5	50 milyon
5 milyon NaCl	1.4	140 milyon
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 milyon
% 50 Gliserol	10	%10
% 10 Oktilfenol etoksilat	2,5	%0,50
% 10 2 - [4- (2,4,4-trimetilpentan-2-il) fenoksi] etanol	1,25	%0,25
Otoklavlanmış ddH2O	50'ye kadar doldurun
Lizis tamponu 2
reaktif	Hacim (mL)	[Final]
0,5 M Tris-HCl (pH 8.0)	1	10 milyon
5 milyon NaCl	2	200 milyon
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 milyon
Otoklavlanmış ddH2O	50'ye kadar doldurun
Lizis tamponu 3
reaktif	Hacim (mL)	[Final]
1 M Tris-HCl (pH 8.0)	0,5	10 milyon
5 milyon NaCl	1	100 milyon
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 milyon
% 10 Deoksikolik Asit	0,5	%0,10
% 30 N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu çözeltisi	0,83	%0,50
Otoklavlanmış ddH2O	50'ye kadar doldurun
Engelleme çözümü
reaktif	miktar	[Final]
Sığır serum albümini (BSA)	250 mg	%0,50
Komple Proteaz İnhibitörü (CPI, 1000x)	50 μL	1 katı
Fosfat tamponlu salin (PBS)	50 mL'ye kadar doldurun

Tablo 2: ChIP yıkama tarifleri: Yüksek Tuzlu Yıkama tamponu, LiCl Yıkama tamponu ve 10 mM Tris-HCl tamponu (pH 7.4). 50 mL'lik tüplerde 4 °C'de saklayın. Kullanmadan hemen önce tüm tamponlara 50 μL 1000x CPI stoğu ekleyin.

Yüksek tuzlu yıkama tamponu
reaktif	Hacim (mL)	[Final]
1 M HEPES (pH 7.3)	2,5	50 milyon
5 milyon NaCl	5	500 milyon
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 milyon
% 10 2 - [4- (2,4,4-trimetilpentan-2-il) fenoksi] etanol	5	%1
% 5 Deoksikolik asit	1	%0,10
%5 SDS	1	%0,10
Otoklavlanmış ddH2O	50'ye kadar doldurun
LiCl yıkama tamponu
reaktif	Hacim (mL)	[Final]
0,5 M Tris-HCl (pH 8.0)	2	20 milyon
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 milyon
1 milyon LiCl	12,5	250 milyon
% 10 Oktilfenol etoksilat	2,5	%0,50
% 5 Deoksikolik asit	5	%0,50
Otoklavlanmış ddH2O	50'ye kadar doldurun
>10 mM Tris-HCl tamponu
reaktif	Hacim (mL)	[Final]
1 M Tris-HCl (pH 7.4)	0,5	10 milyon
Otoklavlanmış ddH2O	50'ye kadar doldurun

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agaroz, Ultra Saf	Canlandırıcı	16500	Sonication'ın Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.3.6)
Albümin, Sığır Serumu (BSA), Proteaz İçermeyen, Isı Şoku İzolasyonu, Min. %98	Biyo Dükkanı	ALB003	Engelleme Çözümü
Isl1'e karşı antikor	DSHB (Türkçe)	39,3F7	Boncuklarla antikor inküsyonu (Bölüm 5.6)
Bioruptor Pico	Diagenode (Şeker Düğümü)	B01060010	Sonikasyon Kromatin (Bölüm 3.3)
Santrifüj 5424 R	Eppendorf Belediyesi	5404000138	Sonikasyon kromatini (bölüm 3.5), sonikasyonu kontrol etme (bölüm 4.3.1, 4.3.3 ve 4.3.4)
Santrifüj 5804 R	Eppendorf Belediyesi	22623508	Hasat, çapraz bağlama ve dondurma hücreleri (Bölüm 1.3), Hücre parçalanması (Bölüm 2.2 ve 2.3), Sonikasyon Kromatini (Bölüm 3.1)
Komple, Mini, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitör Kokteyli	Roche	4693159001	Proteinaz K tamponu ve ChIP Elüsyon tamponu hariç tüm tamponlara eklenir
Deoksikolik Asit Sodyum Tuzu	Balıkçı Bilimsel	BP349	Lizis Tamponu 3, Yüksek Tuz Yıkama Tamponu ve LiCl Yıkama Tamponu
EDTA, 0.5 M, Steril Çözelti, pH 8.0	Biyo Dükkanı	EDT111	Lizis Tamponu 1-3, Sonikasyonun Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.1), Yüksek Tuzlu Yıkama Tamponu, LiCl Yıkama Tamponu ve ChIP Elüsyon Tamponu
Etil Alkol Susuz, %100	Ticari alkoller	P006EAAN	Sonication'ın Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.3.3)
Formaldehit, %36,5-38, %10-15 metanol içerir	Sigma	F8775 Serisi	Hasat, çapraz bağlama ve hücrelerin dondurulması (Bölüm 1.1)
Gliserol, Reaktif Sınıfı, min %99,5	Biyo Dükkanı	GLY002	Lizis Tamponu 1
Glisin, Biyoteknoloji Sınıfı, min. %99	Biyo Dükkanı	GLN001	Hasat, çapraz bağlama ve hücrelerin dondurulması (Bölüm 1.2)
Glikojen, RNA Sınıfı	Termo Bilimsel	R0551	Sonication'ın Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.3.3)
HEPES, 1 M Steril Filtreli Çözelti, pH 7.3	Biyo Dükkanı	HEP003	Lizis Tamponu 1, Yüksek Tuz Yıkama Tamponu
Lityum Klorür (LiCl), Reaktif sınıfı	Biyodükkan	LIT704	LiCl Yıkama Tamponu
ChIP için manyetik boncuklar (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (ChIP için manyetik boncuklar)	Dynabeads Protein G (ChIP için manyetik boncuklar)	Boncuklarla antikor inkübasyonu (Bölüm 5)
Manyetik raf (DynaMag-2 Mıknatıs)	Canlandırıcı	12321D	Bölümlerde birçok adımda kullanılır: 5
N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu çözeltisi, %30 sulu çözelti, %≥97,0 (HPLC)	Sigma	61747	Lizis Tamponu 3
Oktilfenol Etoksilat (IGEPAL CA630)	Biyo Dükkanı	NON999	Lizis Tamponu 1 ve LiCl Yıkama Tamponu
Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol, Biyoteknoloji Sınıfı (25: 24: 1)	Biyo Dükkanı	PHE512	Sonikasyonun Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.3.1)
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS), 1x	Corning	21040Özgeçmiş	Hasat, çapraz bağlama ve dondurma hücreleri (Bölüm 1.3) ve Sonikasyon Kromatin (Bölüm 3.1), Boncuklarla antikor inküsyonu (Bölüm 5.1)
PowerPac Temel Güç Kaynağı	BioRad (BiyoRad	1645050	Sonication'ın Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.3.6)
Proteinaz K Çözeltisi, RNA Sınıfı	Canlandırıcı	25530049	Sonikasyonun Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.2)
Rnase A, Dnase ve Proteaz içermez	Termo Bilimsel	EN0531	Sonication'ın kontrol edilmesi (Bölüm 4.3.2)
Sodyum klorür (NaCl), BiyoReaktif	Sigma	S5886 Serisi	Lizis Tamponu 1-3, Yüksek Tuz Yıkama Tamponu
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS), Elektroforez Sınıfı	Biyo Dükkanı	SDS001	Sonikasyonun Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.1), Yüksek Tuz Yıkama Tamponu ve ChIP Elüsyon Tamponu
Sonikasyon boncukları ve 15 mL Bioruptor Tüpleri	Diagenode (Şeker Düğümü)	C01020031	Sonikasyon Kromatin (Bölüm 3.1 ve 3.2)
Termo Karıştırıcı F1.5	Eppendorf Belediyesi	5384000020	Bölüm 4.2, 4.3.2 ve 4.3.5
Trizma hidroklorür çözeltisi (Tris-HCl), BioPerformance Sertifikalı, 1 M, pH 7,4	Sigma	T2194	10 mM Tris-HCl Tampon
Trizma hidroklorür çözeltisi (Tris-HCl), BioPerformance Sertifikalı, 1 M, pH 8.0	Sigma	T2694	Lizis Tamponu 2, Lizis Tamponu 3, Sonikasyonun Kontrol Edilmesi (Bölüm 4.1), LiCl Yıkama Tamponu ve ChIP Elüsyon Tamponu
VWR Mini Tüp Rocker, Değişken Hız	VWR (VWR)	10159-752	Bölümlerde birçok adımda kullanılır: 1, 2, 5, 6 ve 7
2- [4- (2,4,4-trimetilpentan-2-il) fenoksi]etanol, Triton X-100, Reaktif Sınıfı	Biyo Dükkanı	TRX506	Lizis Tamponu 1, Sonikasyon Kromatini (Bölüm 3.4) ve Yüksek Tuz Yıkama Tamponu

adet Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Dersi ) Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi