Serebellar Organoid Dilimlerin Floresan İmmün Boyanması

Özet

Kaynak: Silva, T. P., et al., İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmün Boyama ile Karakterizasyon. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, organoid olgunlaşmanın göstergesi olan çeşitli serebellar nöronlarda eksprese edilen spesifik hedef antijenleri tanımlamak için serebellar organoid dilimlerinin immünofloresan boyamasını göstermektedir.

Protokol

1. Organoid dilimlerin immün boyanması

1. Organoid kesitleri içeren mikroskop slaytlarını, arka arkaya 50 slayta kadar tutarak 10 mL önceden ısıtılmış 1x PBS'li bir kopma kavanozuna yerleştirin.
   not: Tüm organoid bölümler sıvıya batırılmalıdır.
2. Slaytları dejelatinize etmek için 37 °C'de 45 dakika inkübe edin.
3. RT'de 5 dakika boyunca 50 mL 1× PBS ile 1x'i yıkayın: Slaytları taze 1× PBS içeren bir koparma kavanozuna aktarın.
4. Slaytları 50 mL taze hazırlanmış glisin (Tablo 1) içeren bir küpe kavanozuna aktarın ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
5. Slaytları 50 mL% 0.1 triton içeren bir başa çıkma kavanozuna aktarın (Tablo 1) ve RT'de 10 dakika geçirgenleştirin.
6. 1× PBS ile 5 dakika 2 kez yıkayın.
7. İmmün boyama kabını 1× PBS'ye batırılmış 3 mm kağıtla hazırlayın. Slaytları dilimlerin her tarafını mendille kurulayın ve 3 mm'lik kağıda yerleştirin. Bir Pasteur pipeti ile slaytların tüm yüzeyini, slayt başına 0,5 mL olacak bir bloke edici solüsyonla (Tablo 1) kaplayın. RT'de 30 dakika inkübe edin.
8. Fazla engelleme solüsyonunu çıkarın ve slaytları dilimlerin her tarafında bir mendil ile kurulayın. Bölümlerin üzerine blokaj çözeltisi içinde seyreltilmiş 50 μL primer antikor (Tablo 2) yerleştirin ve lamellerle örtün. Dilimleri önceden hazırlanmış bir immün boyama kabına yerleştirin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
9. Slaytları 50 mL TBST (Tablo 1) içeren bir kovalama kavanozuna aktarın, lamellerin düşmesine izin verin ve TBST ile 5 dakika 3 kez yıkayın.
10. Bölümlerin üzerine blokaj solüsyonu içinde seyreltilmiş 50 μL ikincil antikor yerleştirin ve lamellerle örtün. Dilimleri önceden hazırlanmış immün boyama kabına yerleştirin. RT'de ışıktan korunarak 30 dakika inkübe edin.
11. Slaytları tekrar bir copling kavanozuna aktarın ve 50 mL TBST ile 5 dakika 3x yıkayın.
12. Slaytları dilimlerin her tarafına doku ile kurutun ve dilimleri önceden hazırlanmış bir immün boyama kabına yerleştirin. Bir Pasteur pipeti ile slaytların tüm yüzeyine 0,5 mL DAPI solüsyonu ekleyin. RT'de 5 dakika inkübe edin.
13. Adım 1.9'u tekrarlayın.
14. Slaytları bir mendille dikkatlice kurulayın. Slayt boyunca damla damla 50 μL montaj ortamı ekleyin ve ardından kabarcıkları önlemek için hafifçe bükerek her bir lamel üzerine dikkatlice bir lamel indirin.

Tablo 1: Kriyoseksiyon ve immünoboyama için organoidlerin hazırlanması için çözeltiler. Kriyoseksiyon ve immüno-boyama için organoidlerin hazırlanmasında kullanılan çözeltileri hazırlamak için kullanılan tüm bileşenler ve hacimler listelenmiştir.

Jelatin / Sükroz Nihai konsantrasyon:% 7,5 /% 15 w / w	1. Steril bir Schott Cam Şişede 15 g sükroz ve 7.5 g jelatini tartın ve iyice karıştırın 2. PBS 1x'i 65 °C 'de önceden ısıtın 3. 100 g'lık son ağırlığa önceden ısıtılmış PBS 1x ekleyin ve iyice karıştırın 4. Schott Cam Şişeyi 65 °C'de bir ısıtma plakasına yerleştirin ve jelatin eriyene kadar sallayın 5. Çözelti stabilize olana kadar 37 ° C'de inkübe edin
Glisin Nihai konsantrasyon: 0,1 M	50 mL taze hazırlanmış PBS 1x'e 0.37 g glisin ekleyin.
Triton çözümü Nihai konsantrasyon: %0,1 w/v	1. %10'luk bir Triton X-100 stoğu hazırlayın: 50 mL PBS 1x içinde 5 g Triton X-100 2. 50 mL PBS 1x'e 0,5 mL Triton X-100 stoğu ekleyin.
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, % 0.05 w/v Tween-20	20 mL tris 1 m 30 mL NaCl 5 M 5 mL Tween-20 (%10 stok: 50 mL suda 5 g Tween-20) 1 L'ye kadar su ile doldurun.
Engelleme Çözümü	50 mL TBST'ye 5 mL fetal sığır serumu (FBS, nihai konsantrasyon:% 10 v / v) ekleyin.
DAPI çözümü	10 mL damıtılmış suya 15 μL DAPI stok çözeltisi (1 mg / mL) ekleyin
Mowiol (Mowiol)	1. 6 g gliserole 2,4 g Mowiol ekleyin ve önceden ısıtılmış bir plakada 50 °C 'de 1 saat çalkalayın 2. 6 mL damıtılmış su ekleyin ve 2 saat < br / > çalkalayın 3. 12 mL Tris 200 mM (pH 8.5) ekleyin ve 10 dk çalkalayın 4. 5.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin5. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.

Tablo 2: Birincil antikorlar. İmmün boyama için kullanılan primer antikorlar, klon ve optimize edilmiş dilüsyonlar listelenmiştir.

(İngilizce) Serisi

antikor	Ev sahibi türler	Seyreltme
BARHL1	tavşan	1/500
CALBINDIN	tavşan	1/500
MAP2	fare	1/1000
N-KADERİN	fare	1/1000
NESTIN (NESTIN)	fare	1/400
OLIG2	tavşan	1/500
KIŞI 6	tavşan	1/400
SOX2	fare	1/200
TBR1	tavşan	1/200
TBR2	tavşan	1/200
TUJ1	fare	1/1000

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3 MM kağıt	WHA3030861	Merck
Anti-BARHL1 Antikoru	HPA004809	Atlas Antikorları
Anti-Calbindin D-28K Antikoru	CB28	Kırlangıç
Anti-MAP2 Antikoru	M4403	Sigma
Anti-N-Kaderin Antikoru	610921	BD İletimi
Anti-NESTİN Antikoru	MAB1259-SP	AR-GE
Anti-OLIG2 Antikoru	MABN50	Kırlangıç
Anti-PAX6 Antikoru	PRB-278P	Cesaret
Anti-SOX2 Antikoru	MAB2018	AR-GE
Anti-TBR1 Antikoru	AB2261	Kırlangıç
Anti-TBR2 Antikoru	AB183991	Abcam Belediyesi
Anti-TUJ1 Antikoru	801213	Biyoefsane
Lamel 24x60mm	631-1575	VWR (VWR)
DAPI (DAPI	10236276001	Sigma
Fetal sığır serumu	A3840001	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
Sığır derisinden elde edilen jelatin	G9391	Sigma
Cam Copling Kavanoz	E94	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
glisin	MB014001	NZYtech (Türkçe)
Monotiyokliserol	M6154	Sigma
Mowiol (Mowiol)	475904	Kırlangıç	Montaj ortamı
Triton X-100	9002-93-1	Sigma
Ara-20	P1379 Serisi	Sigma
SuperFrost Mikroskop slaytları	12372098	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	Yapışma mikroskobu slaytları

Serisi Serisi Serisi Serisi (İngilizce) ) Serisi Serisi Serisi Serisi