$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. iPSC / hESC 2D Kültüründen Serebral Organoidler Oluşturma (Gün 0)
Not: Bu protokol, kök hücre (SC) bakımının bir vitronektin veya Geltrex substratı ile kseno içermeyen kök hücre bakım ortamında (SCMM) gerçekleştirildiğini varsayar. Alternatif, yüksek proteinli bir kök hücre kültür ortamı kullanılıyorsa, organoid oluşumuna başlamadan önce SC kültürlerinin en az iki geçiş boyunca SCMM'ye geçirilmesi tavsiye edilir. Protokol, besleyici tabanlı SC kültür yöntemleriyle test edilmemiştir.
- Düzenli SC bakım yöntemlerini kullanarak, kültürleri %50-70 oranında birleşime getirin. Bu genellikle geçişten 3-4 gün sonradır, ancak bu kültür yöntemine ve hücre hattına bağlı olabilir.
not: Tam 2 oyuklu bir organoid plakası üretmek için 6 oyuklu bir plakadan yaklaşık 96 kuyuya ihtiyaç vardır.
- Tespit edilebilir bir farklılaşma olmadan sağlıklı koloni morfolojisi sağlamak için kültürleri 10X-20X büyütmede parlak alan mikroskobu ile inceleyin.
- SCMM'yi sıcak su banyosunda 37 °C'ye getirin ve 50 μL'lik bir şişeyi 50 mM Y-27632 (Kaya inhibitörü) ve 2 mL enzimatik ayırma reaktifini oda sıcaklığına kadar çözdürün.
- Ultra düşük ataşman (ULA) U-tabanlı 96 oyuklu bir plaka, çok kanallı bir P200 pipeti ve 25 mL'lik bir reaktif rezervuarı hazırlayın.
- 50 mL'lik konik bir tüpte 45 mL SCMM'yi alın ve 45 μL 50 mM Y-27632 ekleyin. Ezerek iyice karıştırın.
- SC'leri içeren iki kuyucuğu vakumla aspire edin ve bir P1000 pipeti kullanarak her bir oyuğa hızlı bir şekilde 1 mL enzim içermeyen ayırma reaktifi ekleyin. Plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde 4 dakika inkübe edin.
- İşlem görmüş kuyucukları vakumla aspire edin ve bir P1000 pipeti kullanarak her bir oyuğa 1 mL enzimatik ayırma reaktifi ekleyin.
- Plakayı 37 °C'lik bir inkübatörde 5 dakika daha inkübe edin.
- Plakayı çıkarın ve tedavi edilen kuyucukları inceleyin. Toplanmış hücreleri parçalamak için plakaya hafifçe vurun. Büyük hücre kümeleri hala görünüyorsa, plakayı 37 ° C'de 2 dakika daha inkübe edin. Kümeler artık çıplak gözle görülemeyecek hale gelene kadar bu adımı tekrarlayın.
- Hücreler düzgün bir şekilde ayrıştıktan sonra, ayrışma enzimlerini devre dışı bırakmak için her oyuğa 1 mL SCMM ekleyin. 4 mL hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın ve hücre sayımı için küçük bir alikot alın.
- Bakım plakasında kalan, işlenmemiş kuyucukları 37 °C inkübatöre geri koyun.
- Sayarken, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Toplam hücre sayısını belirleyin ve 60.000 hücre/mL'lik bir süspansiyon elde etmek için ihtiyaç duyulacak SCMM + Y-27632 çözeltisinin miktarını hesaplayın.
- Süpernatanı dikkatlice vakumla aspire edin ve hesaplanan SCMM + Y-27632 çözeltisi hacmini ekleyin. 5 mL'lik bir pipetle 5-10 kez karıştırın ve homojen bir hücre süspansiyonu sağlayın.
- Hücre süspansiyonunu hemen bir reaktif haznesine aktarın ve çok kanallı bir P200 pipeti kullanarak ULA U-tabanlı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 150 μL pipetleyin. Bu, her biri başlangıçta 9.000 hücreden oluşan 96 ayrı organoid üretir.
- Plakayı 1 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyin.
- Plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve plakayı 48 saat boyunca rahatsız etmeyin.
2. Serebral Organoid Bakımı (2. Gün)
- 50 mL'lik konik bir tüpte 17 μL 50 mM Y-27643 ile 17 mL SCMM hazırlayın. SCMM + Y-27632 solüsyonunu sıcak su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.
- Organoid plakayı inkübatörden alın ve 75 μL'ye ayarlanmış çok kanallı bir P200 pipet kullanarak, ilk sıradaki kuyu kenarından yavaşça orta çekin. Ortam çekildikten sonra, gevşek hücreleri ve organoidleri kaldırmak için ortamı hızla kuyuya geri atın. Bunu her satır için tekrarlayın.
not: Bundan sonra "dispersiyon" olarak adlandırılan bu teknik, hücresel kalıntıları ve organoidi süspansiyona kaldırır. Organoid hızla kuyunun dibine çökerken, daha küçük döküntüler askıda kalır ve bir ortam değişikliği ile çıkarılmasına izin verir. Bu, organoidin kültür sırasında hücresel kalıntılarda dinlenmesini önlemeye yardımcı olur.
- Tüm kuyular dağıldıktan sonra, organoidlerin her kuyunun dibine battığından emin olmak için 15 saniye bekleyin.
- Çok kanallı P200 pipeti kullanarak her kuyucuktan 75 μL ortamı yavaş ve dikkatli bir şekilde aspire edin ve bir atık haznesine dağıtın.
not: Çoğu kullanıcı, düzenli beslemeler sırasında ara sıra bir organoid aspire eder. Bu, zamanın yaklaşık %1'inde meydana gelebilir. Yeterli organoidin deneysel zaman noktalarına kadar hayatta kalmasını sağlamak için lütfen buna göre plan yapın.
- SCMM + Y-27632 çözeltisini bir reaktif haznesine aktarın ve çok kanallı P200 pipetini kullanarak her bir organoid kuyucuğuna 150 μL dağıtın.
- Plakayı tekrar 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
3. Serebral Organoid Bakımı (3. Gün)
- 17 mL SCMM'yi 37 °C'ye ısıtın, bu sefer Y-27643 olmadan.
- Çok kanallı P200 pipeti 100 μL'ye ayarlandığında, organoid plakanın tüm kuyucuklarını dağıtın (bkz. adım 2.2). Organoidlerin kuyularının dibine battığından emin olmak için 15 saniye bekleyin.
- Bir atık rezervuarı hazırlayın ve ısıtılmış SCMM'yi bir kaynak rezervuarına aktarın.
- Her oyuktan dikkatlice 125 μL besiyerini aspire edin ve çok kanallı P200 pipeti kullanarak 150 μL taze SCMM ile değiştirin.
- Plakayı tekrar 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
4. Serebral Organoid Bakımı (4+ Gün)
Not: Bu düzenli bakımı enfeksiyona kadar her gün yapın.
- 4. günde beslemeye başlamadan önce, Nöral İndüksiyon (NI) ortamını hazırlayın.
- 250 μL'lik bir 2 mg / mL heparin alikotunu ve 5 mL'lik bir şişe 100X N-2 Takviyesi ile birlikte çözün. 250 μL heparin, 5 mL 100X N-2 ve 5 mL minimum 100X esansiyel Orta-Esansiyel Olmayan Amino Asitler (MEM-NEAA) ile 500 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle Medium/Besin Karışımı F-12 (DMEM/F12) + GlutaMAX ekleyin. Karışık çözeltiyi 500 mL'lik bir filtrede steril filtreleyin.
Not: Kullanılmadığı zaman NI'yi 4 °C'de tutun; NI, taze ortam hazırlanmadan önce iki haftaya kadar sürer.
- 17 mL NI ortamını 37 °C'ye ısıtın.
- Çok kanallı P200 pipeti 100 μL'ye ayarlandığında, organoid plakanın tüm kuyucuklarını dağıtın (bkz. adım 2.2). Organoidlerin kuyularının dibine battığından emin olmak için 15 saniye bekleyin.
- Bir atık rezervuarı hazırlayın ve ısıtılmış NI'yi bir kaynak rezervuarına aktarın.
- Her oyuktan 125 μL ortamı dikkatlice aspire edin ve çok kanallı P200 pipeti kullanarak 125 μL taze NI ile değiştirin.
- Plakayı tekrar 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
5. Zika virüsü ile Organoid Enfeksiyonu (ZIKV) (~Gün 24)
NOT: Yaklaşık 3 haftalık farklılaşmadan sonra, organoid içinde ZIKV enfeksiyonuna oldukça duyarlı olacak büyük nöroepitelyal yapılar ve rozetler görünecektir.
- Earle'ün 1X Dengeli Tuz Çözeltisini (EBSS), 1X fosfat tamponlu salini (PBS) ve NI'yi sıcak su banyosunda 37 °C'ye getirin.
- 1X EBSS'de bilinen konsantrasyondaki ZIKV'yi hedef enfeksiyon çokluğuna (MOI) seyreltin.
not: Viral bir doz yanıtı elde etmek için farklı MOI'lerin titrasyonları önerilir. Bu, virüs türüne göre değişebilir; ATCC VR-1838 ve ATCC VR-1843 için tipik MOI değerleri 0,1 ile 10 arasında değişir).
- Tek kanallı bir P200 pipeti kullanarak tüm ortamı organoid kuyusundan dikkatlice çıkarın. Organoidleri yıkamak için bir P200 çok kanallı pipet kullanarak her bir kuyucuğa hızlı bir şekilde 200 μL 1X PBS ekleyin.
- Tek kanallı bir P200 pipeti kullanarak tüm ortamı organoid kuyusundan dikkatlice çıkarın. İyiye hızlı bir şekilde 50 μL 1X EBSS (sahte enfeksiyon) veya ZIKV virüs çözeltisi ekleyin ve organoidin tamamen suya batırıldığından emin olun. Çalışma için enfekte olacak her organoid için tekrarlayın.
- Plakayı 2 h.
için 37 ° C'lik bir inkübatöre geri yerleştirin
not: Sahte enfekte organoidlerin bu süre boyunca kuluçkaya yatırılması, bozulmamış organoidlere kıyasla büyümelerini önemli ölçüde etkilememelidir.
- Viral inkübasyon tamamlanmadan yaklaşık 30 dakika önce, 25 mL NI'yi 50 mL'lik konik bir tüpe alın ve sıcak su banyosunda 37 °C'ye getirin.
- Viral maruziyet tamamlandıktan sonra, organoidleri her kuyucuk için 200 μL 1X PBS ile yıkayın, organoidlerin 15 saniye çökmesine izin verin ve ardından tek kanallı bir P200 pipeti kullanarak 1X PBS'yi çıkarın.
- Her oyuğa 200 μL taze NI ekleyin ve tekrar inkübatöre yerleştirin.
- İsteğe bağlı: 0 günlük bir zaman noktası için, organoidler enfeksiyondan bir saat sonra görüntülenebilir.
- Dispersiyon yöntemini kullanarak her gün 125 μL NI değiştirerek kültüre devam edin (bkz. adım 4). Bulaşıcı ZIKV parçacıkları içerdiğinden, kullanılmış ortamları ve ipuçlarını uygun şekilde attığınızdan emin olun.