Bir Serebellar Nöron Kültüründe Çift Boyama ile Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Jiajia, L., et al. Serebellar Granül Nöron Kültüründe Floresein Diasetat-Propidyum İyodür Çift Boyama Kullanılarak Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, canlı nöronların yeşil ve ölü nöronların kırmızı göründüğü floresein diasetat (FDA) ve propidyum iyodür (PI) ile ikili boyama kullanarak karışık bir serebellar granül nöron ve glial hücre kültüründen nöronları tanımlama yöntemini gösterir.

Protokol

>1. FDA-PI Çift Boyama ve Serebellar Granül Nöron (CGN) Kültüründe

1. 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 20 μL FDA stok çözeltisi (nihai konsantrasyon: 10 μg/mL) ve 50 μL PI stok çözeltisi (son konsantrasyon: 50 μg/mL) ekleyerek floresein diasetat-propidyum iyodür (FDA-PI) çalışma çözeltisini hazırlayın. Girdap yaparak karıştırın ve bunu buzun üzerine yerleştirin.
   not: Kullanmadan hemen önce FDA-PI çalışma çözümü çalışma solüsyonunu taze olarak hazırlayın.
2. Hücre kültürü plakasını inkübatörden çıkarın. Buzun üzerine koyun.
3. Kültür ortamını aspire edin ve soğuk PBS.
   ile değiştirin not: Çözelti değişikliği yavaş ve dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Pipet uçlarıyla hücrelere dokunmaktan kaçının.
4. Soğuk PBS'yi aspire edin ve soğuk FDA-PI ile değiştirin (12 oyuklu hücre kültürü plakaları için 500 μL/kuyucuk veya 6 oyuklu hücre kültürü plakaları için 1 mL/kuyu). 5 dakika buz üzerinde bırakın.
5. FDA-PI'yi aspire edin ve soğuk PBS ekleyin (12 oyuklu hücre kültürü plakaları için 100 μL/kuyucuk veya 6 oyuklu hücre kültürü plakaları için 50 μL/kuyu).
   not: Görüntü çekerken hücrelerin kurumasına izin verilmemelidir.
6. Floresan mikroskobu kullanarak görüntü çekin. 450 - 490 nm geçiş bandına sahip bir uyarma filtresi kullanın. FDA ve PI için floresan emisyonlarını sırasıyla 520 ve 620 nm'de tespit edin. Aynı koşullar altında, floresan mikroskobunun faz kontrast modunu kullanarak normal ışık altında bir görüntü çekin.
   not: FDA-PI'den sonra 15 dakika içinde fotoğraf çekin. Maruz kalma süresi 100-300 ms'dir ve analog kazanç 2,8x'tir.

2. Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

1. FDA-PI çift boyama için, FDA pozitif katmanı grafik düzenleyici yazılımında PI pozitif katman üzerine sürükleyerek farklı floresan filtreleri ile filtrelendikten sonra tespit edilen hücrelerin görüntülerini kaplayın.
   1. "Katmanlar" panelinin "Opaklık" alanına "%50" girerek FDA pozitif katmanın opaklığını ayarlayın. "Katman" menüsündeki "Görüneni Birleştir" düğmesine tıklayarak iki katmanı birleştirin. "Görüntü"| "Ayarlamalar" | "Parlaklık/Kontrast." Bindirme görüntülerinde FDA ve PI çift pozitif hücre olmadığından emin olun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fetal sığır serumu	Gibco (Gibco)	10099141	yüksek kaliteli FBS kültür için çok önemlidir
×100 glutamin	Gibco (Gibco)	25030081
×100 antibiyotik	Gibco (Gibco)	15240062
BME ortamı	Gibco (Gibco)	21010046
Floresein diasetat	Sigma	F7378 Serisi
Propidyum iyodür	Sigma	P4170 Serisi
Tavşan Anti-GAP43 antikoru	Abcam Belediyesi	ab75810
Fare Anti-GFAP antikoru	Hücre Sinyalizasyonu	3670
Pasteur pipeti	Volac Belediyesi	Z310727	Kullanmadan önce ucunu yuvarlak olarak yakın
6 oyuklu hücre kültürü plakaları	TPP (Cesaret Partisi	Z707759	Kültür için yüksek kaliteli hücre kültürü plakası gereklidir
filtre	Kırlangıç	SLGP033RB
Pipet 5 ml	Excell Biyografi	CS017-0003
Pipet 10 ml	Excell Biyografi	CS017-0004
CO2 İnkübatörü	Termo Bilimsel	311
Floresan mikroskobu	Nikon	TI-S
Floresan filtre ve emisyon küpleri	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Fotoğraf yazılımı	Nikon	NIS Elemanları
Grafik editörü yazılımı	kerpiç	Photoshop CS (İngilizce
Görüntü işleme yazılımı	Nıh	ResimJ

(İngilizce) adet Serisi Serisi )