Drosophila Beyinlerindeki Mantar Vücut Nöronlarının İmmün Boyama ile Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Kelly, S. M., et al. Yetişkin Drosophila melanogaster Beyinlerinde Mantar Gövdesi ve Fotoreseptör Nöronlarının Diseksiyonu ve İmmünofloresan Boyanması. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, mutant Drosophila beyinlerinin mantar cisimciklerindeki fenotipik kusurları görselleştirmek için ayrıntılı bir immün boyama protokolünü göstermektedir. Protokol, mantar gövdesinin uygun morfolojik ve fonksiyonel gelişimini kolaylaştıran aksonal rehberlikte yer alan bir protein olan Fas2'ye karşı antikorların kullanılmasını içerir.

Protokol

1. Fiksasyon ve İmmünofloresan Boyama Prosedürü

1. Bir p200 pipeti kullanarak, disseke edilmiş beyinleri 9 oyuklu tabaktan PTN (0.5 M Sodyum Fosfat Tamponu pH 7.2, %0.1 noniyonik yüzey aktif madde) içinde seyreltilmiş 0.5 mL %4 paraformaldehit ile doldurulmuş 0.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aynı genotipe sahip en az 10 - 15 beyin, bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirilebilir. Kalan tüm adımlar (beyinlerin slaytlara monte edilmesine kadar) 0.5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerinde tamamlanır.
   Dikkat: Paraformaldehit (PFA) çeker ocakta işlenmelidir. PFA atıkları saklanmalı ve uygun şekilde bertaraf edilmelidir. Cam ampullerde satın alınan paraformaldehitin yüzde yirmisi mikrosantrifüj tüplerine aktarılabilir ve ihtiyaç duyulana kadar -20 ° C'de saklanabilir.
2. Bir davlumbazın içinde, beyinleri oda sıcaklığında yavaş hızda sallanarak 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde kuluçkaya yatırın.
3. Fiksasyonu takiben, beyinlerin yerçekimi ile mikrosantrifüj tüpünün dibine yerleşmesine izin verin.
   not: Beyinler bazen mikrosantrifüj tüpünün yan tarafına yapışabilir. Bu meydana gelirse, beynin batmasını teşvik etmek için tüpü işaret parmağı ile başparmak arasında yanal olarak döndürmek veya tüpü bankın üzerine hafifçe vurmak genellikle yardımcı olur.
4. Sabitleyiciyi bir p1000 pipet kullanarak çıkarın ve 500 μL PTN ile iki "hızlı" yıkama gerçekleştirin, bu da beyinlerin yıkamalar arasında mikrosantrifüj tüpünün dibine yerleşmesine izin verir. Bu hızlı yıkamalar sırasında, tüm beyinler yerçekimi ile mikrosantrifüj tüpünün dibine yerleştikten sonra, PTN hemen taze tampon ile değiştirilebilir; Ek yıkama süresine gerek yoktur.
   not: Tipik olarak, tüpte fazladan tampon bırakmak, beynin çıkarılmasını riske atmaktan daha iyidir. Hiçbir beynin tüpten yanlışlıkla çıkarılmadığından emin olmak için genellikle pipet ucunun dikkatli bir şekilde incelenmesi gerekir. Beyinler yanlışlıkla uca pipetlendiyse, onları mikrosantrifüj tüpüne geri dağıtın, beyinlerin yerleşmesini bekleyin ve ardından kalan PTN'yi çıkarmaya devam edin.
5. Son hızlı yıkamadan sonra, üç "uzun" yıkama yapmak için bir p1000 pipeti kullanın: 500 μL PTN ekleyin ve bir külbütör/nutatör üzerinde oda sıcaklığında 20 dakika yıkayın. Gelecekteki tüm "uzun" yıkamalar 20 dakika olmalıdır.
   not: Bu yıkamaları takiben sabit beyinler gece boyunca PTN'de 4 °C'de saklanabilir.
6. Son yıkamayı bir p1000 pipeti kullanarak çıkarın ve beyinleri oda sıcaklığında bir külbütör veya nutatör üzerinde 0,5 mL bloke edici solüsyonda [PTN +% 5 normal keçi serumu (NGS)] oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin.
   1. Keçi sekonder antikorları sonraki protokol adımlarında kullanılacaktır. Başka bir türden ikincil antikorlar kullanılıyorsa, blokaj ve antikor çözeltilerinde o türden normal serum (NGS yerine) kullanılmalıdır.
7. Bir p1000 pipeti kullanarak, bloke edici çözeltiyi çıkarın ve PTN içinde seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin (PTN +% 5 NGS + seyreltilmiş birincil antikor). Bir primer antikoru ilk kez kullanırken, bu antikorun optimal seyreltilmesi ampirik olarak belirlenmelidir.
   not: Mantar vücut nöronlarını görselleştirmek için tipik olarak Fas2'yi tanıyan antikorlar kullanılır. Bu antikorlar, Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan (DSHB) antikor 1D4 olarak temin edilebilir ve PTN +% 5 NGS'de 1:20 oranında seyreltilmelidir.
8. Beyinleri 4 ° C'de 2-3 gece boyunca bir rocker / nutator üzerinde birincil antikor çözeltisinde inkübe edin.
9. Primer antikorlarla inkübasyonun ardından, beyinlerin mikrosantrifüj tüpünün dibine yerleşmesine izin verin ve ardından primer antikor solüsyonunu çıkarın.
10. Bir p1000 pipeti kullanarak, yukarıda Adım 1.4 ve 1.5'te açıklandığı gibi 0,5 mL PTN ile 2 "hızlı" yıkama ve 3 "uzun" 20 dakikalık yıkama gerçekleştirin ve beyinlerin her yıkama arasında yerçekimi ile mikrosantrifüj tüpünün dibine yerleşmesine dikkatlice izin verin.
11. Beyinleri uygun floresan etiketli ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin. İkincil antikorlar genellikle 1:200.
    konsantrasyonda 0.5 mL PTN +% 5 NGS içinde seyreltilir not: Floresan sekonder antikorlar eklendikten sonra, deneyin geri kalanında beyinler karanlıkta tutulmalıdır.
12. İkincil antikor inkübasyonunu takiben, beyinlerin mikrosantrifüj tüpünün dibine yerleşmesine izin verin ve ikincil antikor çözeltisini çıkarın.
13. Yukarıda Adım 1.4 ve 1.5'te açıklandığı gibi 0,5 mL PTN ile 2 "hızlı" yıkama ve 3 "uzun" 20 dakikalık yıkama gerçekleştirin ve her yıkama arasında beyinlerin mikrosantrifüj tüpünün dibine yerleşmesine dikkatlice izin verin.
14. Üçüncü "uzun" 20 dakikalık yıkamanın ardından, mümkün olduğunca fazla tamponu çıkarmak için bir p200 pipeti kullanın.
15. Beyne 75 μL floresan solma önleyici montaj ortamı ekleyin. Karıştırmak için pipet beyinlerini ve montaj ortamını pipet ucuna bir kez yerleştirin. Beyinler mikrosantrifüj tüpünün kapağına veya yanlarına yapışabileceğinden tüpü ters çevirmeyin.
    not: Beyinlerin montaj ortamında askıya alınmasını takiben, florofor söndürmeyi yavaşlatmak için tüpler alüminyum folyoya sarılabilir ve gece boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Gerekirse, beyinler 4 °C'de birkaç gün saklanabilir, ancak ideal olarak mümkün olan en kısa sürede slaytlara monte edilmelidir.

2. Yetişkin D. melanogaster Beyinlerinin Mikroskop Slaytlarına Montajı ve Görüntüleme

1. Bir "köprü" slaydı oluşturun. Pozitif yüklü bir slayt üzerine yaklaşık 1 cm aralıklarla iki "taban" lamel yerleştirin. Sürgünün pozitif yüklü tarafının yukarı baktığından emin olun. Lamelleri Şekil 1A'da gösterildiği gibi oje ile slayta yapıştırın. Her bir taban kapak sürgüsünün üç dış kenarının tırnak cilası ile kapatılması, montaj ortamının bu taban lamellerin altında fitil olmamasını sağlamak için genellikle yararlıdır. Devam etmeden önce ojenin tamamen kurumasını bekleyin (10 - 15 dakika).
2. Slaytı stereomikroskobun altına yerleştirin ve diseke edilmiş beyinleri içeren montaj ortamı solüsyonunu iki lamel arasındaki boşluğa pipetleyin. Daha fazla kontrast sağlamak için, deveboynu ışıklarını tezgah üstü ile paralel olacak şekilde manevra yapmak faydalı olacaktır.
3. Beyinleri slayttan pipetlememeye dikkat ederek bir pipet kullanarak slayttan fazla montaj ortamını çıkarın.
4. Ekstra montaj ortamını fitille uzaklaştırın. Bu, bir sonraki adımda beyinlerin daha hassas bir şekilde konumlandırılmasını sağlayacaktır.
5. Bir çift forseps ve stereomikroskop kullanarak, beyinleri anten lobları yukarı bakacak şekilde bir ızgara düzeninde slayt üzerine yerleştirin.
6. Beynin üzerine bir kapak fişi ("köprü") yerleştirin (Şekil 1A). Köprü kapak kızağının "taban" kapak kızaklarına temas ettikleri kenarlarını kapatmak için tırnak cilası kullanın.
7. Bir p200 pipeti kullanarak, köprünün altındaki orta boşluğu yeni montaj ortamıyla yavaşça doldurun (Şekil 1B). Merkez lamel açık kenarına her seferinde bir damla yerleştirin ve montaj ortamının orta köprü lamel altında fitil olmasına izin verin. Tüm boşluk montaj ortamıyla dolana kadar devam edin, ardından üst ve alt kısmı şeffaf tırnak cilası ile kapatın.
8. Tırnak cilası kuruduktan sonra, slaytları hemen görüntüleyin veya -20 °C'de ışık geçirmez, sıkı bir slayt kutusunda saklayın.
9. Bir hafta içinde, seçilen floresan ikincil antikorlara uygun uyarma lazerleri ve filtre küpleri ile lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak beyinleri görüntüler. Mantar gövdesi nöronlarının Z-yığını görüntüleri tipik olarak 20X veya 40X objektifler kullanılarak elde edilir.

Sonuçlar

Şekil 1. İmmünofloresan görüntüleme için hazırlık olarak beyinlerin montajı. (A) Beyinler, beynin düzleşmesini önlemek için bir köprü kapağı ile SuperFrost Plus kızaklarına monte edilmiştir. Şeffaf tırnak cilası ile SuperFrost Plus pozitif şarjlı bir slayta iki "taban" kapak fişi yapıştırılır ve aralarına disseke beyinler yerleştirilir. Beynin üzerine şeffaf bir "köprü" kapak fişi yerleştirilir ve tab...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mikrodiseksiyon forseps/cımbız	Ted Pella'nın fotoğrafı.	505-Deniz Mili
Sylgard yemekleri	Canlı Sistemler Enstrümantasyonu	DD-50-S-BLK	amazon.com'dan edinilebilir
Fas2 Antikoru	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası	1D4
Chaoptin Antikoru	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası	24B10
GFP Antikoru	Aves Laboratuvarı	GFP-1010
Alexa488 keçi anti-fare İkincil antikor	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A-11001
Alexa488 keçi anti-tavuk İkincil antikor	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A-11039
Alexa647 keçi anti-fare ikincil antikoru	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A-21236
% 20 paraformaldehit	Elektron Mikroskobu Hizmetleri	RT15713
VectaShield	Vektör Laboratuvarları	H-1000
SuperFrost Plus Kaydıraklar	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	99-910-01
Lameller	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	12-553-454
Na Fosfat Tampon monobazik	Sigma	S3139 Serisi
Na fosfat Tampon dibazik	Sigma	S3264 Serisi
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
tırnak cilası	Elektron Mikroskobu Hizmetleri (EMS)	72180
stereomikroskop	KL300 LED ışık kaynağı ile Leica S6D
9 kuyulu çanak (spot plaka)	VWR (VWR)	89090-482
nutator/rocker	balıkçı	22-363-152 veya 88-861-041
35 mm çanak	Genesee Bilimsel	32-103
Sylgard Belediyesi	balıkçı	50-366-794
Kimmendil	balıkçı	06-666
Potansiyel Fiksasyon Tamponları
PTN Tamponu			0.1M NaFosfat, pH 7.2, %0.1 Triton-X-100, Tipik olarak 0.5 L 0.1M NaFosfat tamponu oluşturur ve gerektiğinde bir seferde 50 ml aliquote
Bloomington'dan temin edilebilen Fly Hisse Senetleri
ELAV (C155)-GAL4		BL458	Pan-nöronal GAL4 sürücüsü
w*;;; OK107-GAL4		BL 854	Tüm mantar vücut nöronları için GAL4 sürücüsü (OK107-GAL4 yerleştirme 4. kromozom üzerindedir)
Y(1), W(67C23); C739-GAL4		BL 7362	Alfa ve beta loblar için GAL4 sürücüsü (2. kromozom üzerinde)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64305	Alfa ve beta loblar için GAL4 sürücüsü, ayrıca UAS-CD8-GFP içerir
w*; 201Y-GAL4		BL 4440	Öncelikle mantar gövdesinin gama lobları için GAL4 sürücüsü (2. kromozom üzerinde)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP		BL 64296	Mantar gövdesi gama lobları için GAL4 sürücüsü, ayrıca UAS-CD8-GFP içerir

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi (Görsel Bariyer) Serisi arası Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi