1. Mikroenjeksiyon için hazırlanıyor
- Cam kılcal boru çekme için beş aşamalı protokolü izleyerek, bir mikropipet çektirme kullanarak cam kılcal damarları çekerek (Malzeme Tablosuna bakın) enjeksiyona hazırlanın (Tablo 1).
- İğnenin ucunu (ince duvarlı cam kılcal damarlar [3,5 inç], filamentli, dış çap [OD] 1,14 mm) forseps kullanarak bir açıyla uygun boyuta açın (Şekil 1A).
- Kabarcık olmadığından emin olmak için iğneyi 0,1 mL mineral yağ ile doldurun.
- Mikroenjeksiyon aparatının çelik iğnesinin vidalı kapağını sökünüz. Cam iğne deliğini çelik iğne ile hizalayın ve ardından vidalı kapağı sıkın. Yüklenen iğne mikroenjeksiyon aparatını bir mikromanipülatöre monte edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Mikroenjeksiyon aparatının konumunu, mikromanipülatörün aparatı mikroskop altında esnek bir şekilde hareket ettirebilmesi için ayarlayın. Çelik iğnenin kılcal cam tüpe girmesini sağlamak için belirli bir hacimde parafin yağı boşaltın.
- Enjeksiyon solüsyonunu (1× fosfat tamponlu salin (PBS) veya 5 mg / mL LPS gibi)% 70 etanol ile sterilize edilmiş bir cam slayt üzerine bırakın ve mikroenjeksiyon aparatını, uç sıvı damlasına yerleştirilecek şekilde ayarlayın. İğneye ~ 2 μL enjeksiyon solüsyonu yükleyin.
- Mikroenjeksiyon aparatının iğne ucu yüksek büyütmede larvalarla aynı görüş alanında olacak şekilde mikromanipülatörü (yukarı, aşağı, sol ve sağ ince ayar ayarları) ayarlayın (Şekil 1B).
2. Mikroenjeksiyonlar için zebra balığı montajı
NOT: Zebra balığı beyin gelişimi, döllenmeden sonraki 3 gün içinde (dpf) gerçekleşir ve iyi gelişmiş bir merkezi sinir sistemi ile 5 dpf'de olgunlaşır. Bu nedenle, 5 dpf larvaları, LPS aracılı nöronal hasarın yanı sıra davranışsal ve enflamatuar yanıtları incelemek için zaten uygundur.
- Enjeksiyon zamanlamasının tutarlılığını korumak için zebra balığı larvalarını ilgilenilen aşamaya ulaştıktan yaklaşık 30 dakika sonra enjekte edin.
- Zebra balığı larvalarını uyuşturmak için, trikaini temiz akvaryum suyuyla birleştirin (nihai konsantrasyon w/v trikatin %0.02).
- Bir mikrodalga kullanarak çift damıtılmış suda (ddH2O) % 2'lik bir agaroz çözeltisini eritin. Erimiş agarozu plastik bir tabağa dökün. %2 agaroz kaplı plastik kap 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
- Anestezi uygulanmış larvaları %2 agaroz kaplı plastik kabın merkezine taşımak için plastik bir transfer pipeti kullanın. İğne erişimi için monte edilmiş larvaları beyin tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin.
3. Beyin ventrikülünün enjekte edilmesi
- Mikroskobun büyütme oranını, zebra balığının beyin ventrikül yapısı görüş alanında net bir şekilde görüntülenecek şekilde ayarlayın (Şekil 1B).
- İğneyi dikkatlice beyin tektumunun üzerine yerleştirin (Şekil 1C).
- Mikromanipülatörü kullanarak zebra balığı beyninin derisini iğne ucuyla yavaşça delin.
- 1 nL 1x PBS veya farklı LPS konsantrasyonlarını (1.0, 2.5 ve 5.0 mg/mL) çıkarmak için ayak pedalına basın (bkz. Malzeme Tablosu). Beyin ventrikülüne 1 nL %1 Evans mavisi boyası (PBS'de seyreltilmiş) enjekte edildiği başarılı ventrikül enjeksiyon görüntüleri örnek olarak gösterilmiştir (Şekil 1D). Enjeksiyondan hemen sonra larvaları temiz yumurta suyu (E3) ortamına aktarın. 24 saat sonra, mikroskobik görüntüleme, lokomotif davranış analizi ve diğer göstergelerin belirlenmesi için larvaları toplayın.
