Fare Serebellar Granül Nöronlarında Reaktif Oksijen Türlerinin Neden Olduğu Nöronal Ölümün Modellenmesi

1. Deney Hazırlığı

>NOT: Aşağıdaki stok çözeltileri hazırlanabilir ve kullanıma kadar muhafaza edilebilir.

1. Diseksiyon Çözümü
   1. 3.62 g sodyum klorür (NaCl), 0.2 g potasyum klorür (KCl), 0.069 g sodyum fosfat (NaH₂PO₄ ∙ H₂O) ve 1.306 g D - (+) - Glikozu 500 mL damıtılmış H₂O içinde çözün. Daha sonra, çözeltiye 12.5 mL HEPES Tamponu, 450 μL Fenol kırmızı çözeltisi ve 20 mL Sığır serum albümini (BSA) fraksiyonu V ekleyin. 1 N sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak pH 7.4'e ayarlayın.
   2. 0,22 μm filtre ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın. Bu çözüm bir haftadan 10 güne kadar stabil kalacaktır.
2. Tripsin
   1. % 0.9 sodyum klorür içinde 25 g / L tripsin konsantrasyonunda bir stok çözeltisi hazırlayın. Solüsyonu -20 °C'de saklayın.
3. Tripsin İnhibitörü
   1. 1 g tavuk yumurtası akı tripsin inhibitörünü 100 mL 1 mM HCl içinde çözerek 10 mg / mL konsantrasyonda bir stok hazırlayın. Bu çözeltiyi -20 ° C'de saklayın.
4. Deoksiribonükleaz (DNaz)
   1. 10 mg / mL'lik bir stok oluşturmak için 10 mg DNase 1'i 10 mL steril suda çözün. Solüsyonu -20 °C'de saklayın.
5. MgSO₄
   1. 1 M'lik bir stok oluşturmak için 50 mL damıtılmış suya (_H2O) 6.02 g magnezyum sülfat (MgS04) ekleyin. Solüsyonu 4 °C'de saklayın.
6. CaCl₂
   1. 0.735 g kalsiyum klorürü (CaCl₂∙ 2H₂O) 50 mL damıtılmış H₂O içinde 100 mM'lik bir stok konsantrasyonuna çözün. Solüsyonu 4 °C'de saklayın.
7. Kartal
   1. 3.7275 g KCl'yi 50 mL damıtılmış_H2O'da1 M'lik bir stok konsantrasyonuna çözün. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
8. D-(+)-Glikoz
   1. 1.802 g D- (+) - glikozu 50 mL damıtılmış H₂O içinde 100 mM'lik bir stok konsantrasyonuna çözün. Solüsyonu 4 °C'de saklayın.
9. Hücre Kültürü Ortamı
   1. Hücre kültürü ortamını aşağıdaki gibi hazırlayın: 5 mL ısıyla inaktive edilmiş diyaliz Fetal Sığır Serumu, 500 μL 200 mM L-Glutamin, 100 μL 50 mg / mL Gentamisin ve 1 mL 1.0 M KCL, 50 mL serebellar granül nöron (CGN) kültür ortamı oluşturmak için 1.125 g / L D-Glikoz ile desteklenen 45 mL filtreyle sterilize edilmiş Eagle'ın minimal esansiyel ortamına (E-MEM) eklenmelidir. Ortamı 4 °C'de saklayın.
10. Sitozin Beta-D- Arabino Furanosid
    1. 48 mg sitozin beta-D-arabino furanosidi 10 mL büyüme ortamında 20 mM'lik bir stok konsantrasyonuna çözün. Solüsyonu -20 °C'de saklayın.
11. Poli-D-Lizin
    1. 2 mg / mL'lik bir poli D-lizin stoğu oluşturmak için, 10 mL steril_H2Oila 20 mg poli D-lizin ekleyin. Stok poli D-lizin, -80 ° C'de 100 μL'lik alikotlarda saklanmalıdır.
       not: Aşağıdaki solüsyonlar diseksiyondan önce hazırlanmalı ve kullanıma kadar 4 ° C'de tutulmalıdır.
12. MgSO₄ Takviyeli Diseksiyon Solüsyonu
    1. 300 μL stok MgSO₄ ila 250 mL diseksiyon çözeltisi ekleyin.
13. Tripsin Diseksiyon Çözeltisi
    1. 100 μL stok tripsin ve 12 μL stok MgSO₄ ila 10 mL diseksiyon çözeltisi ekleyin.
14. Tripsin İnhibitörü Çözeltisi 1
    1. 164 μL stok tripsin inhibitörü, 250 μL stok DNaz 1 ve 12 μL stok MgSO₄ ila 10 mL diseksiyon çözeltisi ekleyin.
15. Tripsin İnhibitörü Çözeltisi 2
    1. 1040 μL stok tripsin inhibitörü, 750 μL stok DNaz 1 ve 12 μL stok MgSO₄ ila 10 mL diseksiyon çözeltisi ekleyin.
16. CaCl₂ takviyeli diseksiyon solüsyonu
    1. 10 μL stok CaCl₂ ve 25 μL stok MgSO₄ ila 10 mL diseksiyon çözeltisi ekleyin.
17. Poli D-Lizin Kaplı Kültür Kapları
    1. Kültür kaplarını kaplamak için, 100 μL stok poli D-lizini 40 mL steril H₂O içinde seyreltin. 35 mm Nunc kültür kapları için 2 mL seyreltilmiş poli D-Lizin çözeltisi ekleyin. 4 oyuklu plaka için, her oyuklu oyuklara 300 μL seyreltilmiş poli D-Lizin ekleyin.
    2. Poli D-lizinin, her bir kuyucuğu 4 mL veya 600 μL (sırasıyla 35 mm kültür kapları veya 4 kuyulu plakalar için) steril H₂O ile aspire etmeden ve yıkamadan önce 1 saat bekletin. Daha sonra H₂O'yu aspire edin ve bulaşıkları 1 saat kurumaya bırakın.

2. Beyin Ekstraksiyonu ve Beyincik İzolasyonu

1. Kafa kesme makası kullanarak 6-7 günlük bir fare yavrusunun kafasını kesin. Beynin diseksiyonunu steril bir doku kültürü başlığında gerçekleştirin.
2. Beyni çıkarmak için, bir çift forseps kullanarak kafayı kavrayın ve Şekil 1'de gösterildiği gibi mikrodiseksiyon makası kullanarak cildi başın ön kısmına doğru kesin. Ardından, kontaminasyon riskini en aza indirmek için yeni bir makas kullanarak kafatası kemiğini kesin. Forseps kullanarak beyni kaplayan kafatasını çıkarın ve forseps veya bir spatula kullanarak beyni çıkarın.
   1. Gerektiğinde, beyni bir bütün olarak dışarı çıkarmayı kolaylaştırmak için optik siniri kesin.
3. Beyni,_MgS04 ile takviye edilmiş diseksiyon solüsyonuna yerleştirin. Çözeltiyi ve beyni buzun üzerinde tutun.
4. Beynin çıkarılmasını takiben, bir diseksiyon mikroskobu altında, hala MgSO₄ takviyeli diseksiyon solüsyonu içindeyken beyincikleri beyinden diseke edin ve ince forseps kullanarak meninksleri çıkarın. Beyincik'i ventral tarafına çevirin ve koroid pleksusun çıkarılmasını sağlayın.
5. Serebellayı ~ 1 mL MgSO₄ takviyeli diseksiyon çözeltisi içeren 35 mm'lik bir tabağa koyun.
6. Dokuyu küçük parçalar halinde kesin ve 30 mL MgSO₄ tamponlu diseksiyon solüsyonu içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın.

3. Fare Serebellar Granül Nöron İzolasyonu ve Kültürü

1. Kıyılmış serebral dokuyu içeren 50 mL'lik tüpü 644 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
2. Süpernatanı çıkarın ve 10 mL tripsin diseksiyon çözeltisi ekleyin. Ardından tüpü 37 °C'de 15 dakika yüksek hızda çalkalayın.
3. Tüpe 10 mL tripsin inhibitörü çözeltisi 1 ekleyin ve 2 dakika boyunca hafifçe sallayın.
4. Tüpü 644 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı çıkarın ve 2 mL tripsin inhibitörü çözeltisi 2 ekleyin ve ardından 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
6. Çözelti bulanıklaşana kadar dokuyu 15 mL'lik tüpte ezin. Sonra 5 dakika bekletin.
7. Berrak süpernatanı çıkarın ve süpernatanı 1 mL CaCl₂ takviyeli diseksiyon solüsyonu içeren yeni bir tüpe aktarın.
8. Adım 3.6'dan itibaren peleti içeren tüpün dibine başka bir mL tripsin inhibitörü çözeltisi 2 ekleyin. Tekrar ezin ve 5 dakika bekletin. Süpernatanı çıkarın ve adım 3.7'deki süpernatanı içeren tüpe ekleyin (Bu, adım 3.6-3.7'nin tekrarıdır). Dokunun çoğu mekanik olarak ayrışana kadar bu işlemi tekrarlayın.
9. Her mL süpernatan için süpernatan koleksiyonuna 0.3 mL CaCl₂ takviyeli diseksiyon solüsyonu ekleyin.
10. Tüpün içeriğini karıştırın ve ardından 644 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
11. Süpernatanı çıkarın ve pelete 10 mL taze ortam ekleyin ve karıştırın.
12. Hücreler daha sonra sayılabilir ve 1.5 x 10⁶ hücre / mL'lik bir konsantrasyona seyreltilebilir. Genel olarak, tripsinizasyon süresine ve diseksiyonun verimliliğine bağlı olarak, diseke edilen her beyinden 10 milyon hücre beklendiğini lütfen unutmayın. Önceden yapılmış poli D-lizin plakaları üzerindeki plaka hücreleri. 4 oyuklu plakalar için, plaka 0.5 mL, oyuk başına 7.5 x 10⁵ hücre verir. 35 mm'lik tabaklar için, plaka başına 6 x 10⁶ hücre veren 4 mL plaka.
13. 24 saat sonra, glial kontaminasyonu azaltmak için plakalara sitozin-β-arabino furanosid (AraC) ekleyin. Her mL ortam için 0,5 μL 20 mM AraC gereklidir. Arac'ın eklenmesi bir medya değişikliği gerektirmez. Hücreler 7-8 gün boyunca korunacaksa, bu tedaviyi 3. günde tekrarlayın.
14. Kültürleri 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde tutun ve 5 günü geçen her 2 günde bir her 2 mL ortam için kültüre 100 μL 100 mM glikoz eklenerek besleyin. Tam bir medya değişikliği gerekli değildir.

4. Nöronal Yaralanmanın Modellenmesi

1. ROS ile indüklenen hücre ölümünü (oksidatif stres) indüklemek için, nöronları 75-100 μM hidrojen peroksit (H₂O₂) ile tedavi edin ve H₂O₂ 'ye 5 dakika maruz kaldıktan sonra paralel kültürlerden şartlandırılmış ortama geçin. H2O2'nin kararsızlığınedeniyle, konsantrasyonu 24 saatlik tedaviden sonra kültürde% 50-70 hücre ölümüne neden olacak bir seviyeye optimize edin (Şekil 2).

Şekil 1: Fare beyninin çıkarılması ve beyincik diseksiyonu. (A) 6-7 günlük bir farenin beynini çıkarmak için, bir çift forseps kullanarak, kafayı kavrayın ve bir çift mikrodiseksiyon makası kullanarak cildi noktalı çizgiler boyunca öne doğru kesin. Sadece cildi ve bağ dokusunu kesmeye dikkat edin, çok derin bir kesi kafatasını delebilir ve beyne zarar verebilir. Orta hat boyunca düz olan bu üç kesi ve yanal olarak kıvrılan iki kesi, cildin geriye doğru itilmesine ve kafatasının ortaya çıkmasına izin verir. Açığa çıktıktan sonra, kafatasına makasın ucuyla girilebilir ve önden kesilebilir. Meninkslerin tanımlanmasını ve çıkarılmasını kolaylaştırmak için beyinciklere zarar vermemek için büyük özen gösterilmelidir. Kesildikten sonra, kafatasını soymak için forseps kullanılabilir, bu da beyni açığa çıkarır ve daha sonra bir çift forseps veya spatula kullanılarak soğuk diseksiyon çözeltisine sokulabilir. Beynin çıkarılması için optik sinirin kesilmesi gerekebilir. (B) Kafatasından çıkarıldıktan sonra, meninksler bir çift ince uçlu forseps kullanılarak beyincikten çıkarılmalıdır. (C) Bir çift ince uçlu forseps kullanılarak, beyincik kalan dokudan diseke edilir ve meninkslerin tamamen çıkarıldığından emin olmak için incelenir.

Şekil 2: Serebellar granül nöronlarında nöronal hasarın modellenmesi. 6-7. günden itibaren izole edilen serebella, fareler, bölüm 3'te sunulan prosedürü takiben tek hücrelere ayrılır. Ayrışmayı takiben, hücreler sayılır ve 1.5 x 106 hücre / mL oluşturmak için bir hacim kültür ortamında yeniden süspanse edilir.35 mm'lik tabaklar için 4 mL kaplanır ve plaka başına 6 x 106 hücre verilir. Slaytları görüntülemek için, 0.5 mL kaplanır ve 7.5 x 105 hücre / kuyu verir. CGN'ler daha sonra lentivirüs ile transdüksiyona tabi tutulabilir veya adenovirüs ile enfekte edilebilir. Kaplama gününde adenovirüsün kullanılması (0 gün in vitro (DIV))% 90'dan fazla transfeksiyon verimliliği sağlar ve oksidatif stres ve DNA hasarı yoluyla nöronal hasarın incelenmesine izin verir. 10 μM kamptoteksin (CPT) ilavesi DNA hasarına neden olurken, 75-100 μM hidrojen peroksit (H2O2) oksidatif strese neden olur. H2O2konsantrasyonu, 24 saat sonra% 50 hücre ölümünü indüklemek için optimize edilmelidir. 5 DIV'de adenovirüslerle enfekte olmak, %10'dan daha düşük bir transdüksiyon verimliliği sağlar. NMDA reseptörleri kültürde zenginleştirildiğinde 7 DIV'de, Nöronlar eksitotoksisiteyi indüklemek için 100 μM NMDA ve 10 μM glisin ile tedavi edilebilir. Bu, sonraki görüntüleme analizi veya tek bir nöronun izlenmesi için idealdir. Son olarak, 0 DIV'de lentivirüs ile transdüksiyon, ardından 7 DIV'de 100 μM NMDA ve 10 μM glisin ile muamele, ChIP dizilemesi, protein ekspresyonunun incelenmesi ve canlı / ölü tahlillerin gerçekleştirilmesi dahil olmak üzere kültürün biyokimyasal analizine izin vermek için yeterince yüksek bir transdüksiyon verimliliği (% >80) verir.