$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. İmmünohistokimya
- Timidin analog boyama
- Doku bölümlerini PBS'ye (fosfat tamponlu salin) yerleştirin ve 5−8 bölümü pozitif yüklü bir slayt üzerine monte edin, önden arkaya seri sırayı ve aynı oryantasyonu koruyun. Doku bölümlerinin slaytlara tamamen yapışması için kurumasını bekleyin ve ardından hidrofobik bir kalem veya PAP kalemi kullanarak bir kenarlık çizin.
- Geçirgenleştirme tamponu (% 0.5 TBS (tris tamponlu salin) -triton) ile bölümleri 20-30 dakika geçirgenleştirin. Daha sonra bölümleri TBS-triton kullanarak 2x 5 dakika boyunca yıkayın.
NOT: Permeabilizasyon, hücre içi antikor penetrasyonuna yardımcı olur. Geçirgenlik süresi doku kalınlığına ve antikor etkinliğine bağlı olarak ayarlanabilir. Alternatif olarak, geçirgenlik potansiyelini artırmak için deterjan konsantrasyonu artırılabilir. Ancak geçirgenlik süresi uzadıkça doku kırılganlığı arttığı için çok uzun süre geçirgenleşmemeye özen gösterilmelidir.
- Edu (5-etinil-2'-deoksiuridin) reaksiyon çözeltisini Tablo 1'e göre hazırlayın. Alexa488-azidin nihai konsantrasyonu, 1 mL Edu reaksiyon çözeltisinde 15 μM'dir.
- Edu reaksiyon çözeltisinde bölümleri 30 dakika ila 1 saat inkübe edin ve ardından 3x'i TBS-tritonda her biri 5 dakika yıkayın. Bu adımdan sonra, slaytları ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın. Bu aşamada, bir floresan mikroskobu kullanarak Edu reaksiyonunun çalışıp çalışmadığını kontrol edin. Edu etiketli hücreler bir epifloresan mikroskobu altında floresan yayılacaktır.
- Monte edilmiş doku kesiti protokolü
- İkincil antikorla aynı hayvanlarda yükseltilmiş bloke edici tampon kullanarak, örneğin eşek serumu, 1.1.4 adımından bir slayt üzerine monte edilen doku bölümlerini 30 dakika ila 1 saat boyunca bloke edin ve daha sonra her biri 5 dakika boyunca TBS-tritonda 2x yıkayın.
- Bloke etme adımı sırasında primer antikorları 1:200'de bloke edici tampon solüsyonunda karıştırarak primer antikor (yani tavuk anti-nestini) solüsyonu hazırlayın. Dokunun tamamen solüsyona daldırılmasını sağlamak için slayt başına 250 μL yeterlidir.
- Yıkamaları bloke ettikten sonra doku bölümlerini gece boyunca RT'de bir primer antikor çözeltisinde inkübe edin. Kullanılan birincil antikora bağlı olarak bu adımı değiştirin.
not: Antikorlar yüksek bir arka plana veya spesifik olmayan bağlanmaya sahipse, RT (oda sıcaklığı) yerine 4 °C'de inkübe etmek sonuçları iyileştirebilir. Doku penetrasyonu zayıf olan antikorlar, gerekirse 2 gün boyunca inkübe edilmek üzere bırakılabilir.
- Fazla primer antikoru çıkarmak için doku bölümlerini TBS-tritonda 3x 5 dakika inkübe edin. Daha sonra, doku kesitlerini florofor konjuge ikincil antikorlarda inkübe edin (ör., 1:200'de Alexa 647 anti-tavuk) RT'de 2 saat boyunca bloke edici tampon çözeltisinde hazırlanır.
- Fazla ikincil antikoru çıkarmak için TBS-tritonda 3x doku bölümlerini 5 dakika inkübe edin ve RT'de 15 dakika boyunca PBS'de 1: 100'de 300 μM DAPI (4 ", 6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisi uygulayın.
- Fazla DAPI'yi çıkarmak için doku bölümlerini PBS'de 3x 5 dakika inkübe edin ve pamuklu çubuk veya hassas bir görev mendili kullanarak pap kalem dairesini dokunun etrafından çıkarın. Bölümlerin kurumasını bekleyin ve ardından montaj ortamını ve lamel uygulayın. Slaytları görüntülemeden önce montaj ortamının kurumasını bekleyin.
Tablo 1: İmmünohistokimya için kullanılan solüsyonlar
| Antifriz Çözeltisi | Etilen-glikol 150 mL + sükroz 150 g + 500 mL'ye kadar doldurun 500 mL çözelti için 0.1 M PB |
| Sitrat Tamponu | 9 mL sitrik asit stoğu + 41 mL tri-sodyum sitrat tamponu + 450 mL ddH2O |
| Sitrik asit stoğu | [0,1 M] Sitrik Asit 21 g/1 L ddH2O |
| Tri-sodyum sitrat stoğu | [0,1 M] Tri-sodyum Sitrat 29,4 g/1 LddH2O |
| Tris Tamponlu Tuzlu Su -Triton (TBS -Triton) | TBS'de %0,05 100-x Triton |
| Geçirgenlik Tamponu | TBS'de %0,5 100-x Triton |
| Engelleme Tamponu | 10 mL TBS-Triton içinde 0.33 mL Eşek Serumu |
| Edu Reaksiyon Çözümü | 4 mL [0.1 M] Tris pH 8.5 çözeltisine 1 mg CuSO4·5H 2 O ekleyerek bir CuSO4·5H2Oçözeltisi yapın. Daha sonra dokuya uygulamadan önce CuSO4·5H2Oçözeltisine 1:40 oranında 600 μM Alexa488-azid çözeltisi ve 10 mg / mL L-Na+ askorbat ekleyin. |