$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mikroglial Hücre Kültürü Bakımı
- Sıcak hücre kültürü ortamı (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı; DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin / neomisin (PSN) ile 37 ° C'ye kadar desteklenmiştir.
- -80 ° C'deki depolamadan 18 - 25 geçişinde donmuş BV2 mikroglial hücre stoğu elde edin. Hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözün.
- Hücreleri, 10 ml hücre kültürü ortamı içeren 75cm'lik 2 havalandırmalı bir şişeye nazikçe aktarın.
- Şişeyi 37 ° C'de% 5 CO2 içinde inkübe edin. 24 saat sonra ortamı aspire edin ve yeni ortam ile değiştirin. Hücreleri yaklaşık% 70 - 80 birleşene kadar büyütün.
2. Hücreleri Sayma ve Kaplama
- 37 °C'lik bir su banyosunda, ılık DMEM ve 1x-tripsin-Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi.
- Hücrelerden ortamı aspire edin ve 500 μl tripsin ekleyin. 37°C'de 2-5 dakika inkübe edin.
- Bir kazıyıcı kullanarak, hücreleri şişeden çıkarın ve 5 ml DMEM'de askıya alın. Hücreleri 70 μm'lik bir süzgeçten üç kez 50 ml'lik bir tüpe geçirin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve %10 FBS ve %1 PSN ile desteklenmiş 200 μl DMEM'lik bir son hacimde siyah duvarlı şeffaf bir alt plakada 8.000 hücre / kuyu tohumlayın. Plakayı% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
- Eski DMEM'i çıkarın ve serum açlığı mikrogliasına veda etmek için% 1 PSN ile desteklenmiş 200 μl ısıtılmış DMEM ile değiştirin. Plakayı% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
3. Microglia'yı Etkinleştirme
- Ayrı tüplerde, gümüş nanopartikülleri (AgNP'ler) (0.01, 0.05 veya 0.1 μg / ml) ve araç / nötr kontrolünü (sodyum sitrat, 0.04 mM) serum içermeyen DMEM'de seyreltin ve nihai çalışma konsantrasyonlarına% 1 PSN ile desteklenmiştir.
- Her oyuktan 100 μl ortam çıkarın ve 100 μl uygun tedavi bileşiği ile değiştirin.
- Plakayı 24 saat boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 içinde inkübe edin.
4. Koşullu Medyayı Filtreleme
- Her oyuktan 200 μl ortam süpernatanı toplayın ve toplama tüpü (1.5 ila 2 ml kapasite) ile bir filtreye (10 kDa'lık moleküler ağırlık kesme) aktarın.
- Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 15 dakika
santrifüjleyin.
- Akışı (parçacıklı süpernatan) atın ve filtreyi baş aşağı yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 1.000 x g'da 2 dk.
santrifüjleyin
not: Elde edilen filtrelenmiş ortam (salgılanan sitokinleri içeren) altı kat konsantre edilir.
- %10 FBS ve %1 PSN ile desteklenmiş taze DMEM ile konsantre hacmini 400 μl'ye getirin ve buz üzerinde saklayın.
>5. Hipotalamik Hücre Kültürü Bakımı
- 37 ° C'ye kadar% 10 FBS ve% 1 PSN ile desteklenmiş sıcak DMEM hücre kültürü ortamı.
- 80 ° C'de saklanan 18 - 25 geçişinde donmuş bir hipotalamik (mHypo-A1 / 2) hücre stoğu elde edin. Hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözün.
- Hücreleri, 10 ml hücre kültürü ortamı içeren 75cm'lik 2 havalandırmalı bir şişeye nazikçe aktarın.
- Şişeyi 37 ° C'de% 5 CO2 içinde inkübe edin. 24 saat sonra ortamı aspire edin ve yeni ortam ile değiştirin. Hücreleri yaklaşık% 70 - 80 birleşim noktasına gelene kadar büyütün.
>6. Hipotalamik Hücre Toksisitesinin Belirlenmesi
- DMEM ve 1x-tripsin-EDTA çözeltisini 37 °C su banyosunda ısıtın.
- Hipotalamik hücrelerden ortamı aspire edin ve 500 μl tripsin ekleyin. 37 °C'de 2-5 dakika inkübe edin. Yukarıda 2. adımda açıklandığı gibi bir kazıyıcı kullanarak hücreleri şişeden çıkarın.
- % 10 FBS ve% 1 PSN ile desteklenmiş 200 μl DMEM'lik bir son hacimde siyah duvarlı şeffaf bir alt plakada 5.000 hücre / kuyuda bir hemositometre ve plaka hipotalamik hücreleri kullanarak hücreleri sayın ve gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2'de inkübe edin.
- Çok kanallı bir pipetleyici kullanarak 100 μl eski ortamı çıkarın ve 100 μl filtrelenmiş konsantre şartlandırılmış ortamı 1x'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
- Plakayı% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
- 22 μl resazurin reaktifi ekleyin ve plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 içinde 20 dakika inkübe edin.
- Çok modlu bir spektrofotometre kullanarak, hücre canlılığını ölçmek için floresan (560 nm EX/590 nm EM) kaydedin. Sonuçları bağıl floresan birimleri (RFU) olarak raporlayın.