1. Reaktiflerin ve Ekipmanın Hazırlanması
- 1x Diseksiyon Tamponu Hazırlayın (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sükroz, 5 mM trehaloz, 5 mM hidroksietilpiperazin etan sülfonik asit [HEPES]; pH 7.2).
- 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) hazırlayın.
- % 0.01 Triton X-100 ile 1x PBS kullanarak 1x PBT hazırlayın.
- Meyve suyu agar plakaları hazırlayın.14 Kısaca, 30 g agarı 700 mL H2O ve otoklavda karıştırın. 0.5 g metil paraben'i 10 mL etanol içinde çözün ve 300 mL meyve suyu konsantresine (üzüm veya elma) çözelti ekleyin. Konsantreyi otoklavlanmış bir agar çözeltisine karıştırın ve 10 mm x 35 mm Petri kaplarının kapaklarına dökün.
not: Üzüm agar güç premiksi çeşitli şirketlerden de satın alınabilir (bkz.
- Larvaları mekanik olarak yaralamasına izin veren 5 numara forseps elde edin.
- Standart Drosophila CO2 bazlı anestezi cihazı kullanın.
2. Drosophila Larvalarının Seçilmesi
- 25 ° C'de kültüre edilmiş dolaşan üçüncü instar larvaları içeren bir şişe veya şişe Drosophila alın.
- Görünüşe göre on ayrı 2. veya 3. instar larvası seçin. Üçüncü instar larvaları, ön dallı spiracles'in görünümü ile tanımlanabilirken, ikinci instar larvaları daha küçüktür ve daha çok kulüp benzeri anterior spiracles'e sahiptir.
not: Larva aşamaları zamanlama ile de tanımlanabilir. 25 ° C'de, ikinci instar larvaları yumurtadan çıktıktan yaklaşık 48 saat sonra ortaya çıkar ve üçüncü instar larvaları yaklaşık 24 saat sonra tüy döker. NMJ'deki nörodejenerasyonu incelemekle ilgileniyorsa, ikinci instar larvalarının yaralanması gerekir.
3. Drosophila larvalarının mekanik yaralanmaya hazırlanması
- Tek tek larvaları forseps veya boya fırçası ile dikkatlice toplayın ve hiçbir şekilde sıkıştırmamaya dikkat edin.
- Herhangi bir yiyecek kalıntısını gidermek ve larva hareketliliğini yavaşlatmak için on larvayı doğrudan soğuk 1X PBS veya diseksiyon tamponu içeren bir cam kaba koyun.
4. Drosophila larvalarının mekanik yaralanması ve tedavisi
- Her bir larvayı bir CO2 anestezi cihazına yerleştirin.
- Diseksiyon mikroskobu altında, segmental sinirleri kütikül boyunca görselleştirmek için her larvayı dikkatlice sırt tarafına yuvarlayın.
- Pozisyon boyutu 5 forseps, ağız kancalarından başlayarak larva uzunluğunun yaklaşık 1/2 ila 2/3 yolunda. Yerleştirildikten sonra, segmental sinirleri içeren ventral kütikülün yaklaşık 1 / 3'ünü 5 numara forseps ile sıkıştırın.
- Larva segmental sinirlerinin yaralandığından emin olmak için, segmental sinirleri ezmek için yeterli kuvvet uygulayın, ancak kütikülü sağlam bırakın. Doğru kuvvet miktarını belirlemek için 10 larvayı ezin ve 5 saat sonra ölüm oranının %50'nin altında olduğundan emin olun.
- Yaralanmadan sonra, larvaları yaklaşık 0.5 g maya ezmesi içeren bir meyve suyu agar plakasına dikkatlice aktarın. Bozulmuş hareketliliğe rağmen beslenmeye devam etmek için her larvayı ön ucu maya macunu üzerine gelecek şekilde yerleştirin.
not: Larva segmental sinirlerinin yaralandığından emin olmak için, agar plağına transfer edildikten sonra bozulmuş larva motilitesi gözlenebilir. Yaralı larvalar, yaralanma bölgesinin arkasından etkili bir şekilde felç olur, ancak yine de ağız kancalarını hareket ettirebilir ve beslenebilir. Yaralanmadan sonra yüksek bir hayvan ölüm oranı yaygındır, bu nedenle bir deney için gerekenden %20-50 daha fazla hayvanı yaralamak en iyisidir.
- Maya macunu ve 10 yaralı larva içeren agar plakalarını 100 x 15 mm'lik boş bir petri kabının dibine yerleştirin. Şimdi yaralı larvaları içeren bu petri plakasını nemli bir kağıt havluyla bir agar plakasına örtün ve kağıt havlunun larvalara veya agar plakalarına temas etmediğinden emin olun. Bu Petri kabını oda sıcaklığında (RT) daha büyük, hava geçirmez bir kaba koyun.
- Yaralanma sonrası belirli periyotlardan (6, 12 veya 24 saat) sonra diseksiyon için larvaları alın.
not: Yaralanmanın aksonal hücre iskeleti üzerindeki ani etkilerini incelemek için, larvalar yaralanmadan hemen sonra diseke edilebilir. Aksonal taşıma kusurlarını incelemek için, larvalar yaralanmadan yaklaşık 6 saat sonra diseke edilebilir. Yaralanmadan yaklaşık 12 saat sonra her yerde bulunan proteinlerin birikmesi gözlenebilir ve yaralanmadan 24 saat sonra NMJ'de motor nöronların dejenerasyonu gözlenebilir.