Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Oluşumu

Abstract

Kaynak: Tietz, S. M. et al. Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Nörovasküler Ünitenin Endotel ve Glial Bariyerlerinin Bozulmasının Görselleştirilmesi. (2019)

Bu video, beyne göç eden otoreaktif T hücrelerini aktive etmek için miyelin türevi peptitleri bir adjuvan ile enjekte ederek deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indükleme yöntemini göstermektedir. Boğmaca toksini, kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için uygulanır ve bu T hücrelerinin ve diğer bağışıklık hücrelerinin beyne girmesine izin verir. Bu bağışıklık hücreleri demiyelinizasyona neden olarak sinir iletiminin bozulmasına ve EAE gelişimine yol açar.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. EAE indüksiyonu

1. Bir buharlaştırıcı sistemi kullanarak C57BL / 6 fareleri izofloran ile uyuşturun. Farelerde anesteziyi indüklemek için, fareyi %2,1 izofloran içeren bir yüz maskesine aktarmadan önce küçük bir inkübasyon odasında oksijende %4,5 izoflorana maruz bırakın. Farenin hipotermisini önlemek için bir ısıtma yastığı ile donatılmış bir anestezi ünitesi kullanın.
2. Anestezi uygulanmış fareyi bir elinizle sabitleyin ve önce 30 μL miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)-peptid aa_35-55 (MOG_35-55) / tam Freund adjuvanı (CFA)-emülsiyonunu deri altından arka bacak yanlarına enjekte edin (Şekil 1: 1 + 2; toplam 60 μL; sol kanat 30 μL ve sağ kanat 30 μL) kasık lenf düğümlerine yakın bir yerde.
3. Fareyi karnının üzerine yerleştirin ve kuyruk kökündeki sol ve sağ yumuşak yağ dokusuna 20 μL MOGaa_35-55/CFA-emülsiyonu enjekte edin (Şekil 1: 3 + 4; toplam 40 μL; sol yan kuyruk kökü 20 μL ve sağ taraf kuyruk kökü 20 μL) ve farenin boynuna küçük bir damla MOGaa_35-55/CFA-emülsiyonu (Şekil 1: 5).
4. Fareye intraperitoneal olarak 100 μL Boğmaca toksini (PTx) çözeltisi enjekte edin. Bağırsağa enjeksiyonu önlemek için farenin kafasını vücut merkezinin altında tutun.
5. Farelere beklenen klinik hastalık öncesinde ve sırasında daha yüksek enerji içeriğine sahip yiyecekler sağlamak için idame diyetini (ana besinleri ekstrüde edin: ham protein %18.5; ham yağ %4.5; ham lif %4.5; ham kül %6.5; nişasta %35; metabolik enerji: 13.1 MJ/kg) yetiştirme diyetine (ana besinleri ekstrüde edin: ham protein %23.5; ham yağ %5.5; ham lif %5.7; ham kül %5.7; nişasta %36; metabolik enerji: 14.3 MJ/kg) değiştirin.
6. Yüz maskesini çıkarın ve fareyi bir ısıtma pedi ile ev kafesine aktarın. 10 dakika sonra, farenin tamamen uyanık ve hareketli olduğundan emin olun.
7. İlk tedaviden 48 saat sonra PTx enjeksiyonunu (adım 1.4) tekrarlayın.

2. EAE farelerinin puanlaması

1. Her sabah kafeslerin içine bakarak EAE farelerinin sağlık durumunu kontrol edin.
2. Her öğleden sonra EAE farelerini puanlayın.
3. EAE deneyine dahil olan her bir fareyi kafesten çıkarın ve parmağınızla yukarı doğru hareket ettirerek kuyruğun tonusu olup olmadığını kontrol edin. Sağlıklı bir fare kuyruğunu yukarıda tutacaktır (kuyruğun bir tonusu vardır). Klinik EAE başlamışsa, kuyruk tonusu daha düşük olacak ve kuyruğun kademeli olarak düşmesiyle görülebilecektir. Sonunda, fare kuyruğunu hiç kaldıramayacaktır.
4. EAE deneyine dahil edilen her bir fareyi temiz tezgahın üzerine yerleştirin ve yürüme davranışını gözlemleyin ve belgeleyin. Hastalık şiddetinin değerlendirilmesi için puanlama kriterleri için Tablo 1'e bakınız (EAE skoru).
5. Deneye dahil edilen her farenin ağırlığını değerlendirin ve belgeleyin.
6. Klinik EAE skoru 1 olan farelerin yeterli yiyecek ve su alımını sağlamak için, nemli yiyecekleri kafesin altındaki plastik bir tabağa koyun ve günlük olarak yenileyin.

Results

Şekil 1: EAE indüksiyonu için enjeksiyon bölgelerinin grafiksel gösterimi. 1) Sağ kanada 30 μL MOG emülsiyonu için enjeksiyon bölgesi, 2) sol kanada 30 μL MOG emülsiyonu için enjeksiyon bölgesi, 3) sol kuyruk köküne 20 μL MOG emülsiyonu için enjeksiyon bölgesi, 4) sağ kuyruk köküne 30 μL MOG emülsiyonu için enjeksiyon bölgesi, 5) boyuna küçük bir damla MOG emülsiyonu için enjeksiyon bölgesi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Damızlık gıda	Örnek: PROVIMI KLIBA SA	3336
Ayrı ayrı havalandırılan kafesler, Blue line Tip II veya III	Örnek: Tecniplast	1145T, 1285L
Dişi C57BL / 6J fareler (8-12 hafta)	Örnek: Janvier Labs		Dişiler, 8-12 hafta
18G x 11/2 '' (1.2mm x 40mm) enjeksiyon iğnesi	Örnek: BD, BD Microlance 3	304622
27G x 3/4'' – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) enjeksiyon iğnesi	Örnek: BD, BD Microlance 3	302200
30G x 1/2 '' (0,3 mm x 13 mm) enjeksiyon iğnesi	Örnek: BD, BD Microlance 3	304000
Eksik Freund'un adjuvanı (IFA)	Örnek: Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-24648	4°C'de saklayın
Bakım gıdaları	Örnek: PROVIMI KLIBA SA	3436
MOGaa35-55 peptit	örneğin GenScript		-80 °C'de saklayın
Mikobakteri tüberkülozu H37RA	örneğin BD	231141	4 °C'de saklayın
NaCl % 0,9	B. Braun	3535789
Omnican 50 30G x 1/2 ''	B. Braun	9151125S
Boğmaca toksini	Örneğin, List biological laboratories, Inc.	180	4 °C'de saklayın
Dikiş makası	F.S.T	15012-12
şırınga 1 ml	örneğin PRIMO	62.1002
şırınga 10 ml	Örnek: CODAN Tıbbi ApS	2022-05