$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. İn vivo geçirgenlik deneyi
- Çözeltilerin hazırlanması:
- Dekstran stok çözeltileri için, 10 mg 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 ve 3 kDa Dextran Texas Red'i 500 μL% 0.9 sodyum klorür çözeltisi (20 mg / mL) içinde çözün
.
- Dekstran çalışma çözeltisi için, enjeksiyondan hemen önce 55 μL 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 stok çözeltisini (20 mg / mL) bir parça sızdırmazlık filmi üzerine pipetleyin ve 55 μL 3 kDa dekstran Texas Red stok çözeltisi (20 mg / mL) ekleyin. 100 μL'yi tek kullanımlık ince bir şırıngaya karıştırın ve toplayın (son konsantrasyon 2 mg / 100 μL).
- %10 formaldehit (Paraformaldehit veya PFA) stok çözeltisi için, 10 g PFA ekstra saf toz, 100 mL PBS ve 200 μL 1N Sodyum hidroksit (NaOH) temiz bir cam beherde birleştirin ve manyetik bir karıştırıcı kullanarak karıştırarak tam olarak 56 °C'ye ısıtın. PFA tamamen çözülene kadar 56 °C'de 30 dakika tutun. Oda sıcaklığına soğutun, pH'ı 7.4'e ayarlayın ve bir kağıt filtreden süzün. —20 °C'de saklayın. Stok çözeltisi, Fosfat tamponlu salin veya PBS kullanılarak daha da seyreltilebilir.
- Deneysel otoimmün ensefalomiyelitten muzdarip sağlıklı C57BL / 6 fareleri veya C57BL / 6 fareleri veya izofluran ile EAE'yi kısaca anestezik hale getirin (fare yaklaşık 1 dakika boyunca sedasyona tabi tutulacaktır). Otomatik bir sistem kullanın (fareler bir indüksiyon odasında oksijende% 4.5 izoflurana maruz bırakılacak ve daha sonra% 2.1 izofluran içeren bir yüz maskesine aktarılacaktır).
- Anestezi uygulanmış fareyi masanın üzerinde yanal bir pozisyonda yerleştirin, ardından fare uyanmadan önce intravenöz olarak (örn. retro-orbital olarak) fareye 100 μL floresan izleyici enjekte edin.
- Yüz maskesini hemen çıkarın ve kısa anesteziden sonra farenin tamamen uyanık ve hareketli olduğundan emin olun. İzleyicinin 15 dakika boyunca dolaşmasına izin verin.