$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>Sorumluluk reddi metni: Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. İmmünofloresan boyama
- -80 °C'den itibaren slaytları çıkarın. Slaytları bölümlerin havayla kuruması için 1 saat RT'de tutun. OCT'yi yıkamak ve bölümleri geçirgen hale getirmek için slaytları %0,1 PBST'de (PBS'de %0,1 Polietilen glikol tert-oktilfenil eter; Malzeme Tablosuna bakınız) her biri 5 dakika boyunca üç kez durulayın.
- İsteğe bağlı olarak, antijen alımı gerçekleştirin (isteğe bağlı).
- Sitrat tamponunu (10 mM sodyum sitrat pH 6) boyama kabında bir buharlı pişirici veya su banyosu ile 95–100 °C'ye önceden ısıtın. Slaytları sitrat tamponuna daldırın ve 10 dakika inkübe edin.
- Boyama kabını buharlı pişiriciden veya su banyosundan çıkarın ve slaytları oda sıcaklığında 20 dakika veya daha uzun süre soğutun15.
not: Alternatif olarak, ısıya bağlı antijen alımı için Tris-EDTA tamponu (10 mM Tris bazı, 1mM EDTA, %0.05 Tween 20, pH 9.0) veya EDTA tamponu (1 mM EDTA, %0.05 Tween 20, pH 8.0) kullanın. Sıcak buharlı pişiriciye ek olarak ısıya bağlı antijen alımı için düdüklü tencere, mikrodalga fırın veya su banyosu kullanın. Tripsin veya pepsin kullanılarak enzim kaynaklı bir antijen alımı başka bir alternatiftir. Bölümlere zarar vermekten kaçınmak için enzimatik alımın konsantrasyonunu ve tedavi süresini optimize edin. Her antikor/antijen kombinasyonu için antijen alma yöntemini optimize edin.
- Her slaytı 200 μL bloke etme solüsyonu (% 0.1 PBST içinde seyreltilmiş% 5 eşek serumu) ile RT'de 30 dakika inkübe edin, ardından bloke edici solüsyonu durulamadan çıkarın.
- Her slaytı 100 μL primer antikor veya 4 ° C'de RT'de 1 saat veya O / N'de 1 saat boyunca bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş antikorlarla inkübe edin. RT'de slaytları her biri 10 dakika boyunca PBS ile üç kez durulayın.
- Her slaytı RT'de 1 saat boyunca bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 100 μL ikincil antikor ile inkübe edin. Slaytları RT'de her biri 10 dakika boyunca PBS'de üç kez durulayın. Slaytları ışıktan koruyun.
- Slaytları monte edin.
- Slaytta DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) ile iki damla solma önleyici ortam ekleyin. Sonra bir lamel ile örtün.
- Görüntüye hazır olana kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
not: Alternatif olarak, çekirdekleri önce RT'de PBS'de 1: 2.000 oranında seyreltilmiş DAPI veya Hoechst 33324 boyası ile etiketleyin, ardından gliserol ile monte edin.