Floresan Görüntüleme Kullanılarak Nöronlardaki Vezikül Motilitelerinin Görselleştirilmesi

Abstract

Kaynak: Tsuruta, F., et al. Floresan Problar Kullanılarak Kültürlenmiş Nöronlarda Endozom ve Lizozom Motilitelerinin Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Exp. (2017).

Bu video, nöronal veziküllerin hareketlerini görselleştirmek için belirli floresan proteinlerle nasıl etiketlendiğini gösterir. İlk olarak, bir floresan proteini kodlayan bir plazmit, bir transfeksiyon ajanı ile inkübe edilir ve daha sonra bir nöron kültürüne sokulur. Daha sonra, veziküllerin hareketini izlemek için nöronların görüntüleri elde edilir ve analiz edilir.

Protocol

1. Vezikül Hareketliliğini Görüntüleme

1. Her bir vezikül türünü etiketleyecek plazmitleri hazırlayın. Örneğin, erken endozomlar için EGFP-Rab5, geç endozomlar için EGFP-Rab7, lizozomlar için LAMP-EGFP ve otofagozomlar için EGFP-LC3 kullanın.
   not: Bu plazmitler istek üzerine tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp'dan temin edilebilir. Tipik olarak, 3-5 gün in vitro (Bölünme veya DIV) nöronlar, transfeksiyon reaktifleri kullanılarak bu plazmitlerle transfekte edilebilir.
2. 4.0 μg plazmidleri 200 μL serumsuz ortamla pipetleyerek karıştırın. Ayrı bir tüpte, 8 μL transfeksiyon reaktifini (Malzeme Tablosuna bakınız) 200 μL serumsuz ortamda seyreltin. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
3. Plazmid solüsyonunu ve transfeksiyon naibi solüsyonunu adım 1.2'de pipetleyerek karıştırın. RT'de 20 dakika inkübe edin.
4. Kortikal nöronlar, serebral kortikal kültür ortamı içeren her bir kaplanmış cam tabanlı tabağa serum içermeyen ortam ve adım 1.3'ten 400 μL plazmit çözeltisi ekleyin. Nöronları 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde 30 dakika inkübe edin. Ortamı 2 mL serebral kortikal kültür ortamı ile değiştirin. Nöronları 37 °C'de %5 CO₂ inkübatörde 1-2 gün inkübe edin.
   not: 1x B-27 takviyesi, 2 mM L-glutamin ve 100 U/mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş nöron bazal ortamından oluşan bir serebral kortikal kültür ortamı hazırlayın.
5. 1-2 günlük transfeksiyondan sonra, görüntü elde etmek için transfekte edilmiş hücreleri seçin.
   not: 7 DIV'den daha düşük prematüre nöronlar, dinamik vezikül motilitesi sergileme eğilimindedir. Floresan probunu orta derecede eksprese eden nöronları seçin, çünkü yüksek derecede eksprese eden bir nöron seçildiğinde net görüntüler elde edilemez. Ayrıca, akson ve dendritlerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için uzun aksonlara ve karmaşık dendritlere sahip piramidal nöronlar gibi tipik bir nöronal şekil seçin (bkz. Şekil 1A).
6. Hızlandırılmış görüntüleme sistemi kullanarak görüntü elde etme: Görüntüleme için, 40X Plan Apo 0.95NA veya 100X Plan Apo VC NA1.4 objektif lenslerine sahip Şarj Bağlantılı Cihaz (CCD) kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanın. Bir inkübasyon sistemi kullanarak sıcaklığı 37 °C'de kontrol edin. Görüntü edinme yazılımı tarafından kontrol edilen 100 sn'lik bir süre boyunca bir kare/5 s'de nöron görüntüleri elde edin. Alternatif olarak, görüntüleri daha kısa aralıklarla ve daha uzun süreler boyunca (örneğin, 300 sn'lik bir süre boyunca 2 saniyede bir kare) elde edin.
   not: Sıralı görüntüler almak için birçoğu bu yöntem için uygun olacak çeşitli uygulamalar mevcuttur. Bu nedenle, özel bir uygulama önerilmez; Bunun yerine, her araştırmacı mevcut olan herhangi bir uygulamayı kullanmalıdır.

2. Görüntü Analizi

1. Tüm sıralı görüntüleri Manuel İzleme ile ImageJ yazılımında açın.
   not: Bugüne kadar, Manuel İzleme, izleme deneylerinde yaygın olarak kullanılmıştır. Manuel İzleme, Dr. Fabrice Cordelières tarafından geliştirilmiştir. Ayrıntılı yazılı talimatlar çevrimiçi olarak mevcuttur. Analiz için, yeterli sayıda görüntü ile görüntüleme verilerinin kalitesi iyileştirilir. 20'den fazla resim kullanılması tavsiye edilir.
2. Sıralı görüntüleri birleştirmek için şunları seçin→ → . Tık.
3. → seçin; bir izleme penceresi açılacaktır.
4. Onay kutusuna tıklayın ve parametreler bölümünde izleme parametrelerini tanımlayın.
   not: Zaman aralığı, x/y kalibrasyonu, z kalibrasyonu, merkezleme için arama karesi boyutu, nokta boyutu, satır genişliği ve yazı tipi boyutu dahil olmak üzere çeşitli parametreler ayarlanabilir. Bu basitleştirilmiş tahlilde, hem zaman aralığı hem de x/y kalibrasyonu tanımlanmıştır. Diğer deneysel koşullar altında, diğer parametrelerin de tanımlanması gerekebilir. Burada kullanılan parametreler şu şekildedir: 5 s'dir ve 40X Plan Apo 0.95NA objektif lensi için 0.26642 μm veya 100X Plan Apo VC NA1.4 objektif lensi için 0.10657 μm'dir.
5. Parametreler tanımlandıktan sonra, yeni bir parça başlatmak için üzerine tıklayın.
6. İlgilenilen vezikülleri belirledikten sonra (örneğin, Şekil 1A'da (sağ panel) mavi ve kırmızı ok uçlarıyla gösterilen veziküller), xy koordinatlarını kaydetmek için sıralı görüntülerdeki sinyallerin merkezine tıklayın. Kaydedilen xy koordinatlarının, mesafesinin ve hızının sonuçları yeni bir pencerede gösterilir.
   not: Lizozomlar söz konusu olduğunda, nöronlarda sıklıkla büyük parlak floresan sinyaller (örneğin, Şekil 1A (sağ panel), turuncu ok ucu) gözlenir. Bu sinyaller bazen birikmiş veziküller veya patolojik varisler sergiler, bu nedenle motiliteyi ölçmek için bu sinyallerden kaçınılmalıdır.
7. Tüm ardışık görüntülerden veziküllerin xy koordinatlarını toplamak için adım 2.6'yı tekrarlayın; referans noktası seçildikten sonra, her görüntü otomatik olarak ardışık görüntüye ilerler.
8. Bu verileri yeni bir tabloya (ör. bir elektronik tabloya) aktarın. Uygun bir grafik oluşturmak için uygun yazılımı kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
   not: Verileri analiz etmek için sütunu seçin, bu sütunun tüm değerlerini toplayın ve Şekil 1B'deki gibi bir çubuk grafik olarak bir hareketlilik mesafesi gösterin. Ek olarak, bu adımı tekrarlayın, toplam motilite mesafesinin ortalamasını hesaplayın ve Şekil 1C'deki gibi bir çubuk grafik olarak gösterin. Bir çubuk grafik ve dalga formu verileri oluşturmak için kullanılan yazılım, Malzeme Tablosunda gösterilmektedir.

Results

Şekil 1: Nöronal dendritlerde lizozom motilitesi. (A) Fare kortikal nöronları (4 DIV) 2 gün boyunca LAMP-EGFP plazmidi ile transfekte edildi. Bu görüntü, dendritlerdeki LAMP-EGFP içeren veziküllerin hareketliliğini göstermektedir. İç kısım, LAMP-EGFP pozitif veziküllerin hızlandırılmış görüntüsünü gösterir. Kırmızı ok ucu hareketli bir vezikülü gösterir ve mavi ok ucu dinlenen bir vezikülü gösterir. T...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nörobazal ortam	Termo Balıkçı	21103-049
Opti-MEM	Termo Balıkçı	31985070	Serum içermeyen ortam
Penisilin Streptmisin	Termo Balıkçı	15140122
L-Glutamin	Termo Balıkçı	25030081
B-27 Takviyeleri	Termo Balıkçı	17504044
poli-D-lizin hidrobromür	Sigma	P7280 Serisi
poli-L-ornitin	Sigma	P4957 Serisi
Lipofektamin 2000	Termo Balıkçı	11668027	Transfeksiyon reaktifi
Polietilenimin "Maks"	Poli Bilimler	24765	Transfeksiyon reaktifi. Lipofectamine2000'e alternatif olarak, sterilize edilmiş suda çözünmüş 0.1mg / ml Polietilenimin mevcuttur. Ancak düşük verimlilik ve yüksek toksisitedir.
BIOREVO BZ-9000	Keyence (Cesaret)	Na
Kuluçka sistemi INUG2-K13	Tokay Hit	Na
GraphPad Prism sürüm 6.0	GraphPad Yazılımı	Na
Excel sürüm 15	Microsoft Bilişim Sistemleri	Na
ImageJ sürümü 1.47	Na	Na