Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. İmmünofloresan
- Bloke edici tampon, antikor tamponu, yıkama tamponu 1 ve yıkama tamponu 2 dahil olmak üzere çözeltileri hazırlayın (bkz. Tablo 1).
- Fazla optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğini çıkarmak için dilimleri fosfat tamponu (PB) ile bir kez durulayın.
- Solüsyonu beyin dilimlerini emmeden plastik bir pipetle çıkarın. 1000 μL'lik bir pipetle 250 μL taze PB ekleyin.
Dikkat: Dilimler kurumamalıdır, bu nedenle sıvıları iyice çıkarın ve ekleyin.
- PB'yi plastik bir pipetle çıkarın ve 1000 μL'lik bir pipetle oyuk başına 250 μL bloke edici tampon ekleyin. Çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında (RT) 3 saat inkübe edin.
- İnkübasyon süresi boyunca, bir reaksiyon tüpündeki antikor tamponundaki birincil antikorları seyreltin. Kuyucuk başına 250 μL antikor tamponu kullanın ve uygun miktarda antikor ekleyin (bkz. Tablo 2) 2 μL'lik bir pipet kullanarak doğrudan çözeltiye pipetleyerek. Çözeltiyi birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Uygun karışımı sağlamak için kısa bir süre sonra vorteks.
not: Arka plan floresansını belirlemek için, birincil antikor eklenmeden boyama da yapılmalıdır. Bunun için, dilimi protokole göre birincil antikorlar olmadan antikor çözeltisi içinde inkübe edin.
- İnkübasyon süresinden sonra, bloke edici tamponu plastik bir pipetle çıkarın ve oyuk başına birincil antikorlar içeren 250 μL antikor çözeltisi ekleyin. Dilimleri bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor ile inkübe edin.
- Ertesi gün, dilimleri bir çalkalayıcı üzerinde RT'de 1 3x 10 dakika boyunca yıkama tamponu ile yıkayın.
- Ortamı plastik bir pipetle çıkarın ve oyuk başına 300 μL yıkama tamponu 1 ekleyin. RT'de 10 dakika inkübe edin. 3 kez tekrarlayın.
- Yıkama adımları sırasında, floroforla bağlanmış ikincil antikorları bir reaksiyon tüpündeki antikor tamponunda seyreltin. Kuyucuk başına 250 μL antikor tamponu kullanın ve uygun miktarda antikor ekleyin (bkz. Tablo 2) 2 μL'lik bir pipet kullanarak doğrudan çözeltiye pipetleyerek. Çözeltiyi birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Uygun karışımı sağlamak için kısa bir süre sonra vorteks.
Dikkat: Antikorlar ışığa duyarlı olduğundan, bu noktadan sonraki tüm adımların karanlıkta yapılması gerekir.
- Yıkama adımlarından sonra, yıkama tamponunu plastik bir pipetle çıkarın ve oyuk başına ikincil antikorlar içeren 250 μL antikor çözeltisi ekleyin. Dilimleri karanlıkta RT'de 90 dakika boyunca ikincil antikor ile inkübe edin.
- Dilimleri RT'de 2 dakika boyunca 3x 10x yıkama tamponu ile yıkayın.
- Yıkama adımları sırasında, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:2000 konsantrasyonda 0.1 M PB içinde seyreltin.
- Yıkama tamponunu 2 plastik bir pipetle çıkarın ve oyuk başına 250 μL DAPI çözeltisi ekleyin. Çalkalayıcı üzerindeki RT'de 5 dakika inkübe edin.
- DAPI çözeltisini plastik bir pipetle çıkarın ve 1000 μL'lik bir pipetle oyuk başına 500 μL 0,1 M PB ekleyin.
- Dilimleri mikroskop slaytlarına monte edin.
- Stereoskopun altına bir mikroskop lamı yerleştirin. İnce bir fırça ile slaytın üzerine üç ayrı damla 0,1 M PB ekleyin. Mikroskop lamına damla başına bir dilim yerleştirin.
- Mikroskop lamı üzerindeki dilimleri düzleştirmek ve yönlendirmek için ince fırçayı kullanın.
- Tüm dilimler doğru yerleştirildiğinde, fazla PB'yi bir mendille çıkarın ve slaytı dikkatlice kurulayın.
Dikkat: Beyin dilimlerini tamamen kurutmaktan kaçının.
- Slaytın üzerine 80 μL gömme ortamı ekleyin. Lameli dikkatlice slaytın üzerine indirin, böylece beyin dilimlerini gömün.
- Slaytları çeker ocakta 1-2 saat kurumaya bırakın (ışığa maruz kalmamak için üzerlerini örtün) ve 4 °C.
'de bir mikroskop slayt kutusunda saklayın
not: Protokol buradan duraklatılabilir.
2. Görüntüleme
- Gömme ortamı tamamen sertleştikten sonra, mikroskop lamını konfokal mikroskobun altına yerleştirin.
not: Dekonvolüsyon yazılımı ile birleştirilmiş epifloresan mikroskobu, benzer görüntü kalitesi sağlamalıdır.
- Gri değerlerin maksimum dağılımını sağlamak için birkaç piksel aşırı pozlanacak şekilde her kanal için lazer yoğunluğunu artırarak veya azaltarak lazer ayarlarını yapın.
- Farklı kanallar için tüm beyin diliminin sanal dokularını elde edin.
- Görüntüleme yazılımında, Döşemeler seçeneğini seçin ve Döşeme Bölgesi Kurulumu ile beyin dilimini manuel olarak tanımlayın.
- Destek noktalarını döşeme bölgesi boyunca dağıtın ve Döşeme Bölgelerini/Konumlarını Doğrula'ya basarak farklı destek noktaları için odağı ayarlayın....
- Elde edilen görüntünün istenen çözünürlüğüne ve dosya boyutuna göre Çekim Modunda ayarları yapın ve taramayı başlatın.
- Tarama bittiğinde, sanal dokuyu işlemek için Dikiş işlevini kullanın. Dosyayı Image Export işleviyle bir .tif olarak dışa aktarın.
3. Bilgisayar Tabanlı Analiz
- Bir görüntü için tüm tek kanalları FIJI'ye tıklayarak Dosya| Açık.
- Freehand seçim aracıyla, DAPI kanalında bir yarım küre belirleyin. Düzenle| Seçim| Maske oluştur'u tıklayın.
- Tek kanallar (Mover ve sinaptofizin) için ortalama floresan yoğunluğunu Analiz Et| Ölçü.
not: Her kanal için ortalama floresan yoğunluğu değerlerini belirlemek için farklı kanalları seçtiğinizden emin olun.
- Tek kanallar için ortalama floresan yoğunluğunu bir elektronik tabloya kopyalayın.
- İlgilenilen bir alandaki tek kanallar için ortalama floresan yoğunluğunu, alanı Freehand seçim aracıyla da tanımlayarak belirleyin. Referans olarak bir fare beyin atlası kullanın.
- Tüm yarım küreler ve tüm ilgi alanları için 3.1-3.5 adımlarını tekrarlayın.
not: Daha sonra ilgilenilen bir alandaki değerleri yarımküredeki değerlerle karşılaştırmak için her yarım küre için değerleri ayrı ayrı belirleyin (bkz. adım 4.2).
>4. Veri İşleme
- Arka plan floresansının yüksek olması durumunda, arka planda bir çıkarma işlemi gerekebilir. Bunun için, referans proteine (burada: sinaptofenin) karşı birincil antikor olmadan işlenen dilim için ortalama floresan yoğunluğunu belirleyin ve bu değeri beyin bölgeleri ve hemisferler için elde edilen tüm değerlerden çıkarın.
- Her yarım küre ve her ilgi alanı için tek kanallar için ortalama floresan yoğunlukları belirlendiğinde (bkz. Tablo 3), Taşıyıcı değerini sinaptofizin değerine bölerek Taşıyıcının sinaptofizin oranını hesaplayın (Tablo 3'te sarı). Bu işlemi her yarım küre ve her ilgi alanı için ayrı ayrı gerçekleştirin.
- İlgilenilen alanın yarım küreye oranını belirlemek için bir ilgi alanı için elde edilen oranı, ilgili yarım küre için elde edilen orana (Tablo 3'teki turuncu) bölün.
- Göreceli Hareket Ettirici bolluğunu belirlemek için, 4.2'de elde edilen oranı, 1'den sapmasını belirleyerek yüzdeye çevirin (Tablo 3'te kırmızı). Bu nedenle, 1.25'lik bir oran, ortalamanın %25 üzerinde bir nispi Hareket Ettirici bolluğu verir ve 0,75'lik bir oran, ortalamanın %25 altında bir nispi Hareket Ettirici bolluğu verir.
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan çözümler.
| Sabitleyici (500mL) |
20g paraformaldehit karışımı (toplam konsantrasyon: %4)
50 mL 10x PBS stok çözeltisi (toplam konsantrasyon: 1x)
450 mL en yüksek H2OAd pH NaOH
ile 7.4'e
Not: PBS'deki paraformaldehiti çözmek için çözeltiyi ısıtın. PFA, 70 oC.
'den daha yüksek sıcaklıklarda parçalandığından, 70 °C'nin üzerinde ısıtmayın
Dikkat: PFA toksiktir, potansiyel olarak kanserojen ve teratojeniktir. PFA ile çalışırken eldiven giyin ve çeker ocak altında çalışın. Yutulmasından kaçının. |
| >0.1M PB (1L) |
Stok çözümü X
35,61 g Na2HPO4,2H 2O in 1 L teklif H2O | Stok çözümü Y
27,60 g NaH2PO4,2H 2O in 1 L teklif H2O |
Karışım 385 mL stok çözeltisi X
115 mL stok çözeltisi Y
500 mL teklif veren H2O |
| Blokaj tamponu (50 mL) |
Karışım 1.25 mL normal keçi serumu (toplam konsantrasyon: %2.5)
1.25 mL normal eşek serumu (toplam konsantrasyon: %2.5)
0,5 mL iyonik olmayan yüzey aktif madde (Triton-X100, toplam konsantrasyon: %1)
47 mL 0,1 m PB |
| Antikor tamponu (50 mL) |
Karışım 0.25 mL normal keçi serumu (toplam konsantrasyon: %0.5)
0.25 mL normal eşek serumu (toplam konsantrasyon: %0.5)
0,1 mL iyonik olmayan yüzey aktif madde (toplam konsantrasyon: %0,2)
49,4 mL 0,1 M PB |
| Yıkama tamponu 1 (50 mL) |
Karışım 1 mL normal keçi serumu (toplam konsantrasyon: %2)
49 mL 0,1 M PB |
| Yıkama tamponu 2 (50 mL) |
Karışım 0.5 mL normal keçi serumu (toplam konsantrasyon: %1)
49,5 mL 0,1 M PB |
Tablo 2: Bu protokolde kullanılan antikorlar.
Serisi
Serisi
| >Birincil antikorlar |
| Karşı yöneltilmiş | Ev sahibi türler | RRID (Türkçe) | konsantrasyon |
| Mover | tavşan | AB_10804285 | 1:1000 |
| Sinaptofizin | kobay | AB_1210382 | 1:1000 |
| İkincil antikorlar |
| Hedef türler | Ev sahibi türler | Florofor | konsantrasyon |
| tavşan | eşek | AlexaFluor 647 | 1:1000 |
| kobay | keçi | AlexaFluor 488 | 1:1000 |
Tablo 3: Veri işleme örneği.
adet
| Yarımküre |
| Yarımküre # | Ortalama floresan yoğunluğu Sinaptofizin (A.U.) | Ortalama floresan yoğunluğu Taşıyıcı (AU) | Oran Taşıyıcı/Sinaptofizin | | |
1
2
3
4
5
6 | 29.134
31.008
38.641
30.775
21.658
27.277 | 22.810
24.046
29.324
25.444
18.091
23.364 | =C3/B3 0,783
=C4/B4 0,775
=C5/B5 0,759
=C6/B6 0,827
=C7/B7 0,835
=C8/B8 0,857 | | |
| >Hipokampus |
| Yarımküre # | Ortalama floresan yoğunluğu Sinaptofizin (A.U.) | Ortalama floresan yoğunluğu Taşıyıcı (AU) | Oran Taşıyıcı/Sinaptofizin | Yarım küreye oran | Bağıl Hareket Ettirici bolluğu (%) |
1
2
3
4
5
6 | 35.26
33.955
41.231
39.853
30.129
28.737 | 29.889
27.825
31.978
31.787
27.817
25.861 | =C11/B11 0,848
=C12/B12 0,819
=C13/B13 0.776
=C14/B14 0,798
=C15/B15 0,923
=C16/B16 0,900 | =D11/D3 1.083
=D12/D4 1.057
=D13/D5 1.022
=D14/D6 0,965
=D15/D7 1.105
=D16/D8 1.051 | =(E11-1)*100 8.269
=(E12-1)*100 5.673
=(E13-1)*100 2.200
=(E14-1)*100 -3,528
=(E15-1)*100 10.530
=(E16-1)*100 5,064 |
