Drosophila'da Dorsal Longitudinal Kas Nöromüsküler Kavşaklarının Yapısal Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Sidisky, J. M., et al. Yetişkin Drosophila'da Sinaptik Dejenerasyonun Nörodejenerasyon ile İlişkili Olarak Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, Drosophila'nın dorsal longitudinal kaslarındaki nöromüsküler kavşakların yapısal bütünlüğünü değerlendirmek için bir protokolü göstermektedir. Prosedür, nöronların ve kasların iki farklı antikorla boyanmasını ve mutant ve vahşi tip sinekler arasındaki floresan modellerinin karşılaştırılmasını içerir. Mutant sineklerde nöronal lekelenmede bir azalma, kas yapısı bozulmadan kalırken nörodejenerasyonu gösterir.

Protokol

1. Ani donma ve toraks biseksiyonu

1. Bisection'lara başlamadan önce, uygun kriyo-koruyucu eldivenler ve koruyucu gözlükler takarak bir Dewar şişesini sıvı nitrojen ile doldurun. Bir bıçak kırıcı, tüy bıçaklar, bir çift ince forseps, buz, buz gibi 1x PBS ve kriyojenik cımbız edinin.
2. 1x PBS buzunu soğuk tutmak için bir buz kovası hazırlayın.
3. Tüy bıçağı belirli bir açıyla tutmak için bıçak kırıcıyı kullanın ve küçük bir parçayı koparmak için bıçağı bükün. Bıçak kırıcı daha sonra bıçağı küçük bir neşter olarak kullanılmak üzere yerine kilitleyebilir.
   not: Tüm gruplar için bir bıçak dayanmalıdır. Bıçak kırılırsa veya körelirse değiştirin.
4. P200'e temiz bir pipet ucu ekleyin ve numuneleri taşımak için ucun 1/5'ini çıkarın.
5. Her grup için yeni bir mikrosantrifüj tüpü hazırlayın ve her tüpe 200 μL 1x PBS ekleyin. Bu ikinci tüp, son DLM hazırlıklarını toplamak için kullanılacaktır.
6. Bir Pasteur pipeti kullanarak tüm 1x PBS'yi tüplerden çıkarın.
7. Uygun koruyucu ekipman giyerek, tüpü kriyojenik cımbızla 10 saniye boyunca sıvı nitrojen şişesine daldırın.
   not: Tüpün patlamasını önlemek için tüpler sıkıca kapatılmalıdır.
8. Tüpü sıvı nitrojenden çıkarın ve bir Pasteur pipeti ile numunelere yaklaşık 300 μL buz gibi 1x PBS ekleyin. Numuneleri buz üzerinde tutun.
9. Silikon elastomer ile kaplanmış 10 cm'lik diseksiyon kabına buz gibi 1x PBS ekleyin ve ilk göğüs kafesi modifiye edilmiş 200 μL pipet ile dağıtın.
10. Toraks ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Bir yandan göğüs kafesini konumlandırmak için donuk bir çift forseps kullanın ve diğer yandan göğüs kafesinin orta hattını ortaya çıkarmak için torasik ganglionun bir kısmını çıkarmak için ince bir forseps çifti kullanın.
11. Bıçakla göğüs kafesinin 1/3'ü boyunca sığ bir kesim yapmak için göğüs kafesinin orta hattını kılavuz olarak kullanın.
12. Bıçağı göğüs kafesinden çıkarın ve göğüs kafesini künt forseps ile 45° açıyla konumlandırın. Bıçağı yeniden takın ve göğüs kafesinin orta hattını düz bir şekilde kesin. Bu, iki hemithorace ile sonuçlanacaktır.
13. Bir seferde bir hemitoraks alın ve en ventral lif olan DLM kas lifi F (Şekil 1B) altındaki fazla dokuyu çıkarın. DLM'lere zarar vermeden fazla dokuyu çıkarmak için dikkatli bir şekilde bir veya iki kesim yapmak için bıçağı kullanın.
14. İzole edildikten sonra, hemitoraksı 1x PBS ile doğru tüpe aktarın.
15. Grup başına 10 diseke hemithoraces yapılana kadar 1.6-14 adımlarını tekrarlayın.

2. Yapısal boyama

1. Toraks örneklerini ikiye böldükten sonra, dokuyu dokuya nüfuz etmek ve spesifik olmayan lekelenmeyi önlemek için dokuyu bloke edici tampona (% 0.1 normal keçi serumu ile 1x PBS ve% 7.4'te %0.2 Triton X-100) yerleştirin. Fazla 1x PBS'yi çıkarmak için bir Pasteur pipeti kullanın ve her tüpe 1,5 mL bloke edici tampon ekleyin. Dokuları 4 ° C'de en az 1 saat bloke edin.
2. Numuneleri, sırasıyla motor nöronları ve kas dokusunu boyamak için bloke edici tamponda 1:200'lük bir seyreltmede floresan konjuge bir antikor, yaban turpu peroksidaz 488 (anti-HRP-488) ve 1:1000'lik bir seyreltmede Phalloidin-647 kullanarak yapısal boyama için hazırlayın. Tüp başına 150 μL olacak kadar leke yapın. Lekeyi 4 °C'de, folyo ile kaplanmış veya koyu renkli bir kutuda lekelenmeye hazır olana kadar saklayın.
3. Bloke ettikten sonra, fazla engelleme tamponunu bir cam Pasteur pipeti ile çıkarın.
4. Yapısal lekeyi dağıtmadan önce, lekeyi girdaplayın. Her tüpe 150 μL leke ekleyin. Numuneleri 2 saat boyunca oda sıcaklığında döndürücü üzerindeki karanlık bir kutuya yerleştirin.
5. Lekeyi çıkarın ve dokuları karanlık bir kutuda döndürücü üzerinde 5 dakika boyunca% 0.3 Triton X-100 ile 1.5 mL oda sıcaklığında 1x PBS'de dört kez yıkayın. Numuneler artık bir slayta monte edilmeye hazırdır.

3. Montaj dokusu

1. Numuneleri PBST'de yıkadıktan sonra, lekelenmek üzere dokuyu monte etmek için bir mikroskop lamı hazırlayın. Cam kapak fişleri, P200 pipet, 200 μL pipet uçları, makas, şeffaf takviyeler, düz kenar forsepsleri, solmaya karşı dayanıklı floresan montaj ortamı, oje ve slaytları kapatmak için koyu renkli bir kutu gibi ek malzemeler hazırlayın.
2. Numuneleri tanımlamak için slaydı etiketleyin ve lekeleri gidermek için Kim mendilleriyle temizleyin.
3. Kapak kaymasının hemitoraks numunelerine zarar vermemesini sağlamak için, takviye etiketlerini kullanarak bir "köprü" inşa edin. Bir takviye etiketini ikiye bölün ve her bir yarıyı yaklaşık 15 mm aralıklarla yerleştirin. Bu mesafe, kapak kızağının genişliğinden daha küçük olmalıdır. 5 etiket yüksekliğinde bir "köprüyü" tamamlamak için bu adımı dört kez tekrarlayın.
4. P200 pipetini alın ve numuneleri slayta aktarmak için ucun 1/5'ini keserek bir ucu değiştirin. Numuneler köprünün ortasındaki kızağa aktarılmalıdır.
5. Bir laboratuvar mendilinin kenarını alın ve fazla PBST'yi çıkarın. Forseps kullanarak, DLM'leri tüm numuneler kas tarafı yukarı ve kütikül tarafı aşağı bakacak şekilde düzenleyin.
6. Standart bir P200 pipet ucu kullanarak, hava kabarcıklarını önleyerek sürgüye 70 μL montaj ortamı uygulayın. Ortamı, dışarıdan başlayarak merkeze doğru takviyelerin içinde dairesel bir düzende dağıtın.
7. Takviyelerin üzerine bir örtü kızağı yerleştirin.
8. Lamelin çevresini çevreleyen dış kenarları kaplamak için oje kullanın. Dokunun tam bir sızdırmazlığını oluşturmak için cömertçe uygulayın.
9. Slaytı karanlıkta düz bir yüzeye yerleştirin, en az 10 dakika kurumasını bekleyin ve foto ağartmayı veya floresan kaybını önleyin. Slaytlar artık hemen görüntüleme için kullanılabilir veya daha sonra görüntülemek üzere -20 °C'de bir slayt klasöründe saklanabilir.

Sonuçlar

Şekil 1: ALS'nin Drosophila modelinde DLM sinapslarının ilerleyici denervasyonu. (A) 43 kDa'lık (TDP-43) Katran Bağlayıcı Proteinin insan mutant formunu ifade eden ALS transgenik sineklerinin nesli şemada gösterilmiştir. (B) Resim, yetişkin bir Drosophila'daki bir hemitoraksın şeklini ve yönünü tasvir etmektedir. Protokolü kullanarak, motor nöronları...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 32 Formaldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15714	Doku koruma
Tezgah Rocker	Genesee Bilimsel	31-302	Boyama sırasında dönen numuneler
Bıçak Kırıcı	Güzel Bilim Araçları	10053-09	Tüy bıçağı tutmak için kullanılır
Kapak Fişleri	Balıkçı Bilimsel	12548bir A	Doku montajı için
kriyojenik eldivenler	VWR (VWR)	97008-198	Ellerinizi sıvı nitrojenden koruyun
kriyojenik cımbız	VWR (VWR)	82027-432	2.0 mL tüpü sıvı nitrojen içinde tutun
dewar şişesi-1900 mL	Thomas Bilimsel	5028M54	Sıvı nitrojen tutun
Tüy Bıçakları	Elektron Mikroskobu Bilimleri	72002-01	Neşter Bıçakları
İnce Forecps x 2	Güzel Bilim Araçları	11252-20	Toraksın orta hattını temizlemek için ince bir çift. Diğer çift, bir bileme taşı kullanılarak köreltilebilir.
FITC-konjuge anti HRP	Jackson Laboratuvarları	123-545-021	Motor nöronları lekeler. 1:100 konsantrasyonda kullanılır
dondurucu kutusu (Siyah)	Balıkçı Bilimsel	14100F	Numuneleri ışıktan korur
Cam Pastör Pipetleri	VWR (VWR)	14637-010	Numuneleri aktarmak için kullanılır
cam kaydıraklar	Balıkçı Bilimsel	12550143	Doku montajı için
Montaj Ortamı (VectaShield) Solma Önleyici	VWR (VWR)	101098-042	Montaj ortamı floresan sinyalizasyonunu korur
oje	Elektron Mikroskobu Bilimleri	72180	Mikroskop slaytlarını mühürler
normal keçi serumu	Balıkçı Bilimsel	PCN5000	Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önler
Boya fırçası	Genesee Bilimsel	59-204	Sineklerin aktarılması
Pbs	Balıkçı Bilimsel	10-010-023	Diseksiyon ve boyama için tuzlu su çözeltisi
Phalloidin 647	Abcam Belediyesi	AB176759	Kas dokusunda F-Aktin'i lekeler. 1:1000 konsantrasyonda kullanılır
plastik petri kabı (100 mm)	VWR (VWR)	25373-100	Diseksiyon tabağı
Takviye Etiketleri	W.B. Duvarcı	AVE05722	Takılan doku üzerinde cam lamel için destek sağlar
bileme bloğu	Grainger	1RDF5	İnce forsepsleri keskin tutmak ve ayrıca ayrı bir çifti köreltmek
Slayt Klasörü	VWR (VWR)	10126-326	Numune depolama
Standart Ofis Makası	W.B. Duvarcı	ACM40618	Takviye etiketlerinin kesilmesi
Sylgard 184	Elektron Mikroskobu Bilimleri	24236-10	Diseksiyon çanağı için kaplama
Triton-X-100	Elektron Mikroskobu Bilimleri	22140	Dokuya nüfuz etmeye yardımcı olur
Vannas Disssection Sissors	Güzel Bilim Araçları	1500-00	Sinek bacaklarının çıkarılması ve toraks üzerinde bir kesi yapılması için kullanılır