Zebra Balığı Larva Beyin Hasarının Büyük Ölçekli Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Kullanılarak İncelenmesi

Özet

Kaynak: Kuipers, J. et al., Sağlıklı ve Yaralı Zebra Balığı Beyninin Büyük Ölçekli Taramalı İletim Elektron Mikroskobu (Nanotomi).J. Vis. Uzm. (2016).

Bu videoda, yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için hem taramalı elektron mikroskobu (SEM) hem de transmisyon elektron mikroskobu (TEM) unsurlarını birleştiren bir teknik olan büyük ölçekli taramalı transmisyon elektron mikroskobu (STEM) kullanarak zebra balığı larva beyin hasarını araştırmak için bir yöntem gösterilmektedir. Beyin hasarını tanımlamak için numunelerin hazırlanması ve yüksek çözünürlüklü STEM görüntülerinin elde edilmesiyle ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

1. Numune Hazırlama

1. Sabitleme ve gömme
   1. Fiksasyon
      1. E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO_4, 10 mM HEPES, pH 7.6) zebra balığı suyuna eklenen trikain (%0.003) içindeki balık larvalarını anestezik hale getirin ve hareket artık algılanmayana kadar diseksiyon mikroskobu altında 200 μl'lik bir pipet ucu ile hafifçe dürterek anestezi derinliğini test edin (Şekil 1A).
      2. Tarif edildiği gibi %1.8 agarozda konfokal veya 2 foton görüntüleme kullanarak in vivo görüntüleme verilerini elde ettikten sonra korelasyon elektron mikroskobu (EM) için numuneleri işlerken, Triton-X-100 (%0.05) içeren fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %4 paraformaldehit (PFA) kullanarak larvaları agarozda sabitleyin.
      3. Larvaları agarozdan kesin ve büyük ölçekli EM için işleyin.
      4. Larvaları Triton-X-100 (% 0.05) içeren PBS'de 2 saat boyunca plastik tüplerde oda sıcaklığında taze% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
         not: Kültürde (in vitro) büyütülen hücreler, bir sonraki adımda (1.1.1.5) açıklandığı gibi doğrudan glutaraldehit içinde sabitlenebilir.
      5. Çözeltiyi çıkarın ve 100 μl %0.5 PFA, %2 glutaraldehit (GA) ve 0.1 M sodyum kakodilat (pH 7.4) ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de saklayın. Numuneleri 0,1 M sodyum kakodilat içinde iki kez durulayın.
      6. Osmiyumun penetrasyonunu kolaylaştırmak için larva başlarını rostral olarak arka beyne kesin. İnce şırıngalar/forseps kullanın.
      7. % 1 osmiyum tetroksit (OsO₄) /% 1.5 potasyum ferrosiyanür (K₄ [Fe (CN) ₆]) içinde 0.1 M sodyum kakodilat içinde 2 saat buz üzerinde larvaları düzeltin ve çift damıtılmış H₂O'da 3 x 5 dakika durulayın.
      8. Artan etanol konsantrasyonlarında (% 50,% 70, 3 kez% 100) 20 dakikalık inkübasyonlarla etanolde dehidrat.
   2. Katıştırma
      1. EM laboratuvarlarında kullanılan standart tariflere göre epoksi reçineyi hazırlayın.
         not: Epoksi reçineyi şu şekilde kullanıyoruz: 19.8 g glisit eter 100, 9.6 g 2-dodekenilsüksinik asit anhidrit ve 11.4 g metilnadik anhidrit manyetik bir karıştırıcı kullanarak karıştırın. 0,5 g DMP-30 (tris- (dimetilaminometil) fenol) ekleyin ve tekrar karıştırın.
      2. Larvaları gece boyunca etanol (v/v) içinde dönerken (RT) %50 epoksi reçine içinde kuluçkaya yatırın.
      3. Seyreltilmiş epoksi reçineyi saf reçine ile değiştirin. 30 dakika inkübe edin, tekrar taze reçine ekleyin ve 30 dakika daha inkübe edin. Tekrar reçineyi yenileyin ve ardından RT'de 3 saat, ardından 58 °C'de 15 dakika ve düşük basınç altında (200 mbar) RT'de 1 saat daha inkübe edin.
      4. Kafaları, piyasada bulunan silikon düz gömme kalıplarında, bir iğne veya kürdan kullanarak, ön kısmı kalıbın yan tarafına bakacak şekilde veya gerektiği gibi bir diseksiyon mikroskobu altında yönlendirin (Şekil 1B).
      5. Epoksi reçineyi gece boyunca 58 °C'de polimerize edin. Epoksi reçine hala çok yumuşaksa, 58 °C'de polimerize olması ve sertleşmesi için bir gün daha bekleyin. Forseps kullanarak basınç uygulayarak sertliği test edin. Bu kolayca bir girinti bırakırsa, 58 ° C'de polimerleşmesi ve sertleşmesi için bir gün daha bekleyin. Numune tamamen sertleştiğinde, kırpma ve kesit alma işlemlerine devam edin.
      6. Tıraş bıçağı kullanarak saplamadaki fazla reçineyi kesin (Şekil 1B).
2. Kesit Alma, Kontrast Oluşturma ve Montaj
   1. Bölümlere ayırma
      1. Bir ultramikrotom kullanarak epoksi reçine bloğu kesiti.
      2. Doğru konumlandırmayı tespit etmek için toluidin mavisi/bazik fuksin (Şekil 500D) boyama için yarı ince kesitleri (1 nm) kesmek için bir cam bıçak veya elmas histoknife kullanın.
      3. Mikroskobik lamlar üzerindeki yarı ince kesitleri, ucu alevde eritilerek kapatılmış cam Pasteur pipet ile toplayarak aktarın. Su kalmayana kadar sıcak bir tabakta kurutun. Sıcak bir plaka üzerinde su içinde% 1 toluidin mavisi ile 10 saniye boyayın ve su ile duruladıktan sonra,% 1 sodyum tetraborat içinde% 0.05 bazik fuksin ile 10 saniye boyayın. Normal bir ışık mikroskobu ile 10X ila 40X'te inceleyin.
      4. Beyindeki uygun bölgeye/oryantasyona ulaşıldığında, ultra ince kesitleri kesmek için epoksi reçine bloğunu bir elmas bıçakla kesitlere ayırmaya devam edin (~ 70 nm; Şekil 1E)
      5. Ultra ince kesitleme sırasında ilgilenilen bölgeyi belirlemek ve numune eğildiğinde kesit açısını ayarlamak için koku alma çukurları, gözler ve gri-beyaz madde sınırları dahil olmak üzere beynin içinde ve çevresinde kolayca tanımlanabilen anatomik yapıları kullanın.
      6. Izgara çubukları tarafından kesintisiz alıma izin vermek için bölümü tek yuvalı L2 x 1 bakır ızgaralara (Şekil 1F) monte edin. Bölümleri desteklemek için Formvar kaplı ızgaraları kullanın.
   2. Zıt
      1. Metanol içinde %2 uranil asetat içinde ızgaralar üzerinde 2 dakika boyunca ultra ince bölümleri ve ardından 2 dakika daha Reynolds kurşun sitrat ile boyayın.

2. Görüntü Edinme

1. Büyük Ölçekli Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu (STEM)
   not: STEM algılamayı kullanarak yüksek çözünürlükte birden fazla geniş görüş alanı elde edebilen harici bir tarama jeneratörü ile EM taraması kullanıyoruz. Tipik olarak, bu şekilde oluşturulan bir görüntü, ~ 100 Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) görüntüsünün görüş alanlarına eşdeğerdir ve dikiş miktarını önemli ölçüde azaltır.
   1. Numunenin Mikroskopta Montajı
      1. Kesitli ızgarayı çoklu ızgara numune tutucusuna yerleştirin ve SEM'in odasına aktarın.
   2. STEM Dedektörünün Hizalanması
      1. Numunenin bulunduğu ızgarayı ışının altına yerleştirin ve lens direğinden yaklaşık 5 mm uzakta olacak şekilde yukarı hareket ettirin. Lens içi dedektörü kullanarak 20 kV'ta bir görüntü elde edin.
      2. Izgara kenarına odaklanın ve çalışma mesafesini 4,0 mm'ye ayarlayın.
      3. Numune tutucuyu güvenli bir konuma getirin ve STEM dedektörünü içeri getirin.
      4. Lens içi dedektör ile maksimum hızda görüntüleme yaparken ayar vidalarını çevirerek STEM dedektörünün deliğini görüntü alanında ortalayın.
      5. Lens direği ile dedektör arasına tam olarak sığacak olan numune tutucuyu dikkatlice geri getirin.
      6. Kesit alanında olduğundan emin olmak için lens içi dedektörle bir görüntü elde edin.
      7. STEM algılamaya geçin (kazanç ortamı ve tüm kadranlar 'eksi' olarak ayarlandı), bir görüntü elde edin ve taranacak alanı seçin.
      8. Hızlanma voltajını 21 kV'a yükseltin ve ışının stabilizasyonunu bekleyin (tekrar kararlı görüntü), ardından 29 kV'luk adımlarla 2 kV'a çıkın.
   3. Görüntülerin Alınması
      1. Taranacak alanın tamamı görüntü penceresine sığacak şekilde uzaklaştırarak örneği önceden ışınlayın (e-ışının neden olduğu parlaklık değişikliklerini önlemek için).
      2. Diyaframı 120 μm olarak değiştirin (uygun dinamik aralığı korumak için dedektör kazançlarının bir adım azaltılması gerekir).
      3. Görüntünün bulanık olması için odağı kaldırın.
      4. Azaltılmış alan tarama seçeneğini kullanarak taranan alanı mümkün olduğunca sıkı hale getirin.
      5. Tarama hızını, bir kare yaklaşık 1 - 2 sn.
         içinde taranacak şekilde ayarlayın not: Boyuta ve dokuya bağlı olarak, bu tipik olarak 1/2 saat (100 x 100 μm görüş alanı (FOV)) ila 3 saate (1.000 x 500 μm) kadar sürer.
      6. En az 100X yakınlaştırın ve küçük bir alanı 10 sn.
         tarayın not: Bu alan çevresine göre parlaklığını değiştirmediğinde ön ışınlama yeterli olmaktadır.
      7. 30 μm açıklığı (ve ortada STEM kazancını) geri getirin
      8. Örneğe odaklanın.
      9. Wobbler'ı kullanarak diyaframı hizalayın (~ 40.000X büyütmede).
      10. Odaktayken, en açık alanı/özelliği seçin ve tarama hızını ayrıntılar görünecek şekilde ayarlayın.
      11. Mikroskop yazılımında, tüm pikselleri dinamik aralıkta tutmak için histogramı dikkatlice izleyerek parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. En karanlık alan/özellikler için de aynısını yapın.
      12. Parlak alana geri dönün ve tekrar kontrol edin. Histogramın her iki tarafında da biraz boşluk olması için güvenli tarafta olun.
      13. Taranacak alanın tamamı görüntüleme penceresine sığacak şekilde uzaklaştırın ve geniş alan yakalama programını başlatın.
      14. Ekrandan bir alan seçerek bir mozaik ayarlamak için sihirbaz seçeneğini kullanın. Hangi ayrıntıların gerekli olduğuna bağlı olarak 2 - 5 nm piksel boyutunu kullanın. STEM için 3 μs bekleme süresi kullanın.
      15. "Önceki döşemede otomatik odaklama" seçeneğini seçin, varsayılan şirket ayarlarıyla büyük ölçekli edinme yazılımı otomatik odaklamasını kullanın, "yürütmeden önce ayarı doğrula" kutusunu işaretleyin ve verilerin nereye kaydedileceğini tanımlayın.
      16. Mikroskop ayarlarını kontrol etmek için "optimize" düğmesine basın.
          not: Şimdi, gereken süre gösterilecektir. Bu, 1 x 0,5 mm'lik alanlar için 72 saate kadar olabilir.
      17. Pencerede, "maksimum döşeme çözünürlüğü" 20.000 yazın, böylece tek tek döşemeler 20k x 20k'den büyük olmayacak ve kör kenar etkilerini önleyecektir. Yürüt" e basın.
      18. Odak ve Parlaklık/Kontrast (B/C) kontrol edilmesi istendiğinde, harici tarama oluşturucuyu kapatın ve mikroskop yazılımında odak ve astigmatizmayı dikkatlice ayarlayın. B/C.
          değiştirmeyin not: Sahne alanı hareket ettirilebilir ve büyütme değiştirilebilir, ancak büyütmenin istenen piksel boyutuna geri ayarlanması gerekir.
      19. Harici tarama oluşturucuyu tekrar açın ve "devam et"e basın.

Sonuçlar

Şekil 1: Zebra Balığı Beyinlerinde Büyük Ölçekli Doku Elektron Mikroskobunun İş Akışı. (Bir)7 günlük zebra balığı larvası. (B) Epoksi reçineye yan yana gömülü zebra balığı larva başları. (C) Numuneyi yarı ince kesitlere ayırmak ve yönlendirmek için cam bıçak. (D) İki yan yana gömülü zebra balığı larvasını gösteren temsili yarı ince toluidin mavisi le...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kimyasal
Düşük erime noktalı agaroz	VWR (VWR)	444152G
Tricaine	Sigma	E10521
Triton- X-100	Sigma	X100
Glutaraldehit	Poli Bilimler	1909
Sodyum kakodilat	Sigma	C0250
osmiumtetroksit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	19114
potasyumferrosiyanür (K4[Fe(CN)]6)	Merck	4984
etanol	VWR (VWR)	20821.365
uranil asetat	Merck	8473
sodyum tetraborat	Merck	1063808
Tolduiden mavisi	Merck	1273
Temel Fuchsin	BDH (Türkçe)	340324
Kurşun sitrat	BDH (Türkçe)	Üretilmiyor
EPON (EPON)
2-dodekenilsüksinik asit anhidrit	Serva	20755
metilnadik anhidrit	Serva	29452
Glikit Eter 100	Serva	21045
DMP-30	Poli Bilimler	553
Standart düz gömme kalıbı	Elektron Mikroskobu Bilimleri	70901
elmas bıçak	Atom A.Ş.
bakır ızgaralar	Elektron Mikroskobu Bilimleri
çift taraflı karbon bant	Elektron Mikroskobu Bilimleri
EM Zeiss Supra55 Tarama	Zeiss
ultramikrotom Leica EM UC7	Leica Belediyesi
Atlas harici tarama jeneratörü	Fibics (Ahlaki)

Serisi Serisi · Serisi adet Serisi